树锦鸡儿枯枝病病原菌的分离鉴定

周仪 刁辰 贾含琪 刘忠玄 董爱荣 刘雪峰

摘 要：树锦鸡儿枯枝病（Caragana arborescens （Amm.） Lam. branch blight）是在树锦鸡儿枝干上发现的一种新病害，在自然条件下于老龄树枝上多发，产生橙黄色子实体并导致枝条枯死。为明确该病害的病原菌，了解其发生和侵染，本文根据柯赫氏证病法，对该病害进行分离、接种和再分离确定病原菌，结合形态学和分子生物学对病原菌进行鉴定。研究结果表明：在室内用烧伤、划伤和无伤3种方法接种健康3 ～ 5 a生水培枝条，30 d后仅烧伤接种表现出典型症状，说明该病原菌不能从寄主的自然孔口或直接穿透表皮入侵，属于一种弱寄生病害。经形态学特征比对和rDNA-ITS序列分析将引起该病害的病原菌鉴定为树锦鸡子座丛赤壳菌（Stromatonectria caraganae （H?hn.） Jaklitsch & Voglmayr. ）。

关键词：树锦鸡儿枯枝病;病原鉴定;树锦鸡子座丛赤壳菌

中图分类号：S763.15;949.32 文献标识码：A 文章编号：1006-8023（2018）06- 0007-06

Isolation and Identification of the Pathogen of Caragana arborescens

（Amm.） Lam. Branch Blight

ZHOU Yi1， DIAO Chen2， JIA Hanqi1， LIU Zhongxuan1， DONG Airong1， LIU Xuefeng1*

（1.College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040; 2.Forestry Bureau of Xinbin County， Fushun 113200）

Abstract：Caragana arborescens （Amm.） Lam. branch blight is a new disease which was found firstly on the branches of C. arborescens in Harbin， Heilongjiang province. Under natural conditions， this disease occurs on relatively old branches， producing bright orange sporophores and then causing the branches to die. The occurrence and the invasion progress of the disease was investigated and the pathogen was identified through isolation， inoculation and re-isolation with Kochs postulates. The species of the pathogen were identified basing on morphological and molecular characteristics. In laboratory， burning， scratching and original ones were used to inoculating 3-5 years old healthily-growing hydroponics branches. After 30 days， only the burnt inoculation showed typical symptoms. The result of pathogenicity test shows that the disease cant penetrate through the natural orifice of the host and invade directly， therefore it is a weak parasitic disease. By the research on morphologic properties and rDNA-ITS sequences of the isolated strain， the pathogen of C. arborescens branch blight was identified as Stromatonectria caraganae （H?hn.） Jaklitsch & Voglmayr.

Keywords：Branch blight of Caragana arborescens （Amm.） Lam.;pathogens identification;Stromatonectria caraganae

0 引言

樹锦鸡儿（Caragana arborescens （Amm.）Lam.）是豆科锦鸡儿属植物，为小乔木或大灌木。主要分布在我国的东北以及山东、河北和陕西等地区。由于该树种具有较强的抗寒性，早春萌芽力强，且叶形优美，所以目前在城市园林中备受关注[1]。大量的相关研究表明[2-4]树锦鸡儿具有良好的抗逆性，在防风固沙方面表现良好，因此在很多地区都作为恢复植被的优先树种。由于该树种抗病性良好，多年来人们的研究多集中于树锦鸡儿的抗性及繁殖，主要在叶部病害，对于其病害方面研究较少。阎科技对同为锦鸡儿属植物中柠条的常见病害及预防进行过报道[5]，包括柠条叶锈病、花棒白粉病、煤污病和柠条叶枯病;2006年张如力等报道了除锦鸡儿叉丝壳（Microsphaera caraganae）[6]和长丝叉丝壳（M. longissima）[7]外第三种寄生在锦鸡儿上的白粉菌——锦鸡儿束丝壳（Trichocladia sp.）。国外对于树锦鸡儿病害研究最多的是白粉病及病毒病。1964年，在华沙第一次在树锦鸡儿叶片上发现病毒病。到2010年Kochman等对该病毒病进行系统的描述[8]。在北美洲及加拿大等地区，树锦鸡儿被认为是一种带有入侵性的外来灌木。在2002年7月分别在莫斯科和普尔曼边境的树锦鸡儿上发现有白粉病的发生。至2009年7月病原菌帕氏叉丝壳（Microsphaera palczewskii Jacz. ）引起的白粉病，先后在北美加利福尼亚州、阿拉斯加州、北达科他州、明尼苏达州、威斯康星州和魁北克市的树锦鸡儿上被发现，但均无大规模发病的报道[9-12]。

2017年，在黑龙江省哈尔滨市东北林业大学校园中发现有树锦鸡儿枯枝病的发生，其病部产生鲜艳的橙黄色子实体，经查阅国内外有关文献，未发现该枯枝病的相关报道，为一种新病害。本文以在哈尔滨市东北林业大学校园中采到的树锦鸡儿枯枝病病枝及健康枝条为材料，依据柯赫氏法则，进行了病原菌的分离和鉴定，确定了树锦鸡儿枯枝病的病原菌。为进一步研究该真菌对树锦鸡儿的致病性、侵染途径以及该病害的防治提供理论支持，打造科学基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2017年4月从东北林业大学校园采集到具有明显病征的树锦鸡儿枯枝病病枝标本数枝，带回实验室用做病原菌的形态学鉴定和分离的材料。并于病害标本采集附近的树锦鸡儿和紫穗槐上采集健康的3～5 a生枝条做接种材料。

1.2 症状观察

在校园中对树锦鸡儿枯枝病的发病症状进行观察。采集回来的病枝标本借助手持放大镜以及实体解剖镜对发病部位进行观察，注意其危害部位和危害症状，以及其在寄主表面的排列状况和颜色等。

1.3 病原菌的分离纯化

将所采集具有典型症状的发病枝干标本用自来水冲洗干净，然后将发病部位产生的子实体连同树皮沿枝干剥下，用灭菌纱布包起来放入到次氯酸钙（1 ： 14倍）上清液中消毒4 min，取出用无菌水反复冲洗3次，再置于已灭菌的吸水纸上，吸干表面残余水分后用灭菌的解刨刀从中间切开，切面朝下接入PDA培养基上，每皿放5块组织材料，每组处理设6次重复，放入25 ℃的培养箱中进行避光培养[13]。 分离纯化后获得纯菌落，保存菌种于PDA斜面培养基上。

1.4 致病性测定

1.4.1 病菌接种

室内接种采用划伤、烧伤和无伤3种接种方法对健康的树锦鸡枝条进行接种。采用离体枝条水培接种。分别用无菌水和树锦鸡儿树皮煎汁（100 g树皮，1 000 mL水，煮沸30 min 冷却）将组织分离培养产生的病原菌孢子配成孢子悬浮液（数量大致为400倍镜视野下200个孢子左右），以备接种。从园间采集3～5 a生的健康树锦鸡儿枝干，仔细清洗干净，用枝剪剪成长20 cm左右小枝条，置于水龙头下流水冲洗15 min进行表面清洁，用保鲜膜将接种枝条的形态学上端封住，用酒精擦拭接种点。

无伤接种，随机在健康且长势较好的3～5 a生枝条上选取接种点。划伤接种，用无菌手术刀划5 mm×5 mm的“×”形伤口作为接种点，深度以划破树皮为准。烧伤接种，将接种点置于酒精灯外焰上烧伤，时间约2 s，听到树皮有轻微爆裂声即可，烧伤后树皮仅出现直径约5 ～ 7 mm的黄色爆皮区，烧伤如周围树皮颜色未見变化，且用刀片刮开树皮可见内部仍呈绿色，与未烧伤部位颜色相同如图1（a）所示。用1 mL孢子悬浮液浸湿脱脂棉后包裹接种点。每组处理20株，接种后保鲜膜包扎保湿48 h。以上3种接种方法均以无菌水浸湿脱脂棉包裹为对照，并定期观察病害的发生和发展情况。

同时对树锦鸡儿的同科植物紫穗槐进行接种实验。采用烧伤接种的方法进行离体枝条水培接种，共接种20株，并以无菌水接种作为对照。检测病原菌是否对豆科中的其他植物具有可侵染性。

根据室内接种的结果选择烧伤法进行野外接种实验。2017年6月采用麦芽汁液体培养基于25 ℃、160 rpm、黑暗条件下将病菌摇培7 d，用该菌液浸湿无菌脱脂棉进行野外接种。共接种6株，每株选择7个枝条，每个枝条设置一个接种点，接种后保鲜膜包扎保湿48 h。同时以无菌麦芽汁液体培养基浸湿脱脂棉包裹作为对照。

1.4.2 病原菌再分离

定期观察接种枝条的发病状况，对病原菌进行再分离，纯化。

1.5 病原菌形态特征鉴定

取发病枝条，对发病部位进行切片镜检，观察病原菌的形态，确认是否有病原菌的繁殖体或营养体。将致病菌株接种在PDA培养基上，置于25 ℃，黑暗条件下培养。观察其生长速度、菌落颜色和形态等，制成临时玻片并在光学显微镜下观察菌丝及其产孢状况。

1.6 病原真菌ITS分子鉴定

选取分离自树锦鸡儿病枝上具有致病性的菌株，取3块直径为0.5 cm的菌块接种于100 mLPD液体培养基中，25 ℃、160 rpm、黑暗条件下摇培7 d，高速离心获得孢子及菌丝体混合物。用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech （Beijing） Co. ，LTD.）提取DNA。使用真菌通用引物ITS1（5-TCCGTAGGT -GAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCGCTTATT-GATATGC-3）对样品DNA进行PCR扩增[14]。

PCR产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化和测序。使用NCBI网站中的BLAST工具将测得的DNA序列进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 树锦鸡儿枯枝病症状

树锦鸡儿枯枝病自然状况下多发生在老龄或者衰弱枝条上，在一根枝条上一处或多处发生，子实体聚集或不规则散开，由于老龄枝条树皮厚颜色深，仅能观察到子实体的产生及枝条枯死，但在人工接种的条件下3～5 a生的枝条均可发病。接种枝条的发病初期产生浅黄色的病斑，后病斑逐渐扩大且颜色加深。病原菌的子座初埋生于寄主皮下，肉眼可见树皮下有小突起，后横向开裂，突破树皮，裂口处乳白色到淡黄色，光滑。子座逐渐外露，裂口处向外凸起，每个子座上产生1至多个分生孢子器，颜色逐渐加深变为橙黄色，子座不规则形，表面不均匀。子实体的分布范围随病斑的扩大而扩大。成熟的分生孢子器在潮湿时会有大量孢子从孔口处涌出，在孔口处聚集，形成孢子粘液。

2.2 树锦鸡儿枯枝病病原菌分离的结果分析

通过对树锦鸡儿病枝进行组织分离得到一种菌落颜色为白色的菌株，经一段时间的培养后在菌落表面产生橙黄色的子实体，与树锦鸡儿枝条上产生子实体的形态特征十分相似。故将该菌株命名为S2，并以此为基础进行该菌株的致病性测定。

2.3 致病性测定结果

2.3.1 室内接种及发病组织再分离结果

从病枝分离的纯培养物，在室内采用无伤、划伤和烧伤3种方法对健康的树锦鸡儿离体枝条进行接种，每隔5 d观察一次，记录其发病情况。初始烧伤仅造成约直径5 mm的爆皮区域;5 d后接种部位开始慢慢变色，变色区长约1.5 cm，宽约1 cm，随时间的增加接种区变黄并开始向四周扩展，交界部位颜色加深;在接种20 d时，烧伤接种的枝条上开始产生不同程度椭圆形的小突起，少数横向开裂，裂口处乳白色，树皮变为深黄色，且枝条的健康与发病部位的交界处颜色变黑;接种30 d，烧伤接种的枝条上产生与自然发病的病害标本十分相似橙黄色的子实体，至此时发病面积已扩散至长3 cm，宽1.5 cm（图1）。其中烧伤接种的枝条发病较多，无伤接种条无发病现象，划伤接种的接种部位颜色变深，初期略有塌陷，后期划伤的边缘部位开始突起，但始终未产生病原菌子实体。各接种方法的发病情况统计见表1。

对烧伤接种发病的枝条进行组织分离，均能再次获得了与S2相同的菌株。再分离后得到的菌株菌落形态、分生孢子器及分生孢子形态大小均与S2菌株一样。即可确定S2菌株为引起树锦鸡儿枯枝病的病原菌。

对紫穗槐的接种枝条连续观察30 d，接种病原菌的紫穗槐无任何症状。即该病原菌不能成功侵染紫穗槐。

2.3.2 野外接种结果

采用烧伤接种进行野外接种。第12天枝条烧伤的部位开始出现不同程度的小突起和开裂，至第20天枝条接种部位产生橙黄色的子实体，接种42株，发病数为35株，发病率高达83.3%。对照组未见发病（图2）。

2.4 病原菌形态学及分子鉴定结果与分析

S2菌株在PDA培养基上25 ℃黑暗条件下培养，表面白色，平板背面淡黄色。暗培养30 d后取出见光，见光7 ～ 10 d逐渐在菌落边缘部分开始产生白色球状的子座，成熟后变为橙黄色。在病枝标本上，该病原菌子实体为橙黄色至橙红色，每个子座上产生1至多个分生孢子器。分生孢子梗为瓶梗状，轮生2 ～ 8或单侧再分枝。分生孢子单细胞，无色，圆柱形或轻微弯曲，（3.1～5.4）μm×（0.8～1.5）μm（= 50）。PD液体培养基在25 ℃摇培3 ～ 4 d后摇培液变浑浊，镜检发现菌丝上开始分枝产生分生孢子，产孢细胞瓶梗样，7 d后镜检，400倍镜下一个视野中孢子超过200个，但菌丝量很少，整个视野中几乎全是孢子。根据以上形态特征鉴定该菌为树锦鸡子座丛赤壳菌（Stromatonectria caraganae）（图3）。

将PCR扩增得到的 r DNA-ITS 序列在NCBI BLAST上进行比对，其中S2与GenBank中Stromatonectria caraganae（GenBank ID：HQ112288，菌株號：CBS 125579）的覆盖度和相似度为99%。本文将树锦鸡儿枯枝病病原菌S2的序列在GenBank上进行了注册，菌株号为MG190345。结合形态学鉴定及相关文献，鉴定此菌为树锦鸡子座丛赤壳菌。

3 结论与讨论

根据柯赫氏法则对采集到的树锦鸡儿病枝进行病原菌的分离、接种和再分离，确定病原菌。并根据菌落的形状、颜色和生长速度，产生孢子及分生孢子器的基本形态进行鉴定，得出该病原菌即为树锦鸡子座丛赤壳菌，与随后的分子鉴定结论一致。

树锦鸡子座丛赤壳菌是子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、  生赤壳科（Bionectriaceae） 、子座丛赤壳属（ Stroma- tonectria）真菌。2011年M. Jaklitsch[15]等对该菌进行了重新描述，在生赤壳科建立了一个新属——子座丛赤壳属（Stromatonectria），将该菌归类于其中，并命名为树锦鸡子座丛赤壳菌（S. caraganae）。在国外该菌被发现寄生在豆科植物（Fabaceae）中锦鸡儿（Caragana spp.）、鱼鳔槐（Colutea arborescens）、金链花（Laburnum anagyroides）的树枝上。在国内仅发现于树锦鸡儿的树枝上[16]，而对于其致病的方面，未见报道。

树锦鸡儿枯枝病病害调查的结果表明，自然条件下仅发现该病在树锦鸡儿的老龄及衰弱枝条上，但随后进行的致病性实验则表明其在3～5 a生的健康枝条上亦可发生，无伤接种和划伤接种不能发病，只有烧伤接种可大量发病，故该病原菌属于一种弱寄生菌。且该菌的潜育期较短，烧伤接种30 d后就表现出典型症状。丛赤壳菌中可引起枯枝病的真菌种类还有很多，譬如2015年报道的油松枯枝病，该病害的发病症状与树锦鸡儿枯枝病相似，其病原菌为松丛赤壳菌（Nectria cucurbitula Sacc. ）。对该菌致病性测定的实验结果表明，该菌不能通过寄主的自然孔口入侵[17]，与树锦鸡子座丛赤壳菌同属于弱寄生性真菌。对松枯梢病的大量研究表明，该病害是一种寄主主导性病害，当异常天气的出现导致树势衰弱时，其致病能力增强[18-19]。

同时实验数据表明，野外接种的发病率高达83.3%，比室内接种发病率高出30%左右，且发病时间短，仅12 d就产生发病症状，比室内接种提早8 d。这可能是因为野外接种的接种物为麦芽汁培养基摇培液，营养丰富，孢子浓度大且包含少量的菌丝;同时在时间方面也略有差异，室内接种是在4月份进行的，东北地区天气寒冷，离体枝条本身营养有限且将其移入室内温暖环境后迅速长叶开花，导致枝条内营养大量消耗，加上室内环境较为干燥，不利于病原菌孢子的萌发与菌丝的生长;而野外接种是在6月份进行的，接种时恰逢下雨，空气潮湿而温暖，加上枝条营养充分，为病原菌的定殖与扩展创造了良好的条件，对接种实验的结果也有一定的影响。该菌在病枝上成熟后产孢量大，分生孢子器在潮湿时会有大量孢子从孔口处流出，推测该菌在下雨时可以通过孢子随雨水传播。结合研究表明，若条件适合，该病也有大规模发生的可能性。在随后进行的实验发现该病原菌在紫穗槐上不具有致病性，可见其寄主范围不覆盖所有的豆科植物，由于条件有限，对于豆科中其他木本植物是否具有普遍的致病性还需进一步研究。

对于这种寄主主导的弱寄生性病害，可以采取适当的营林措施，预防为主，综合治理[20]。通过抚育措施，适当间伐与修枝，清除地表杂灌与野草，提高树势[21]。秋季植株进入休眠期，要清除带病及衰老枝条，并集中烧毁，减少病原菌来源。由于该病害寄主范围较窄，可营造混交林，提高生物多样性，防止病害的传播和蔓延[22]。

同时在进行病原菌鉴定的过程中，未发现该菌的有性型，在自然寄主及人工培养基上均以无性型的形式出现。國内有关于该菌的研究较少，更多信息有待于进一步研究。

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