不同DNA提取方法对肺癌血浆循环DNA抽提效果比较

李旺胜 唐一通 张楚微 王书菲 徐洲 杜陈 金钊

摘要：目的：研究不同DNA抽提方法对肺癌血浆循环DNA的提取效果。方法：选取68例肺癌患者为研究对象，比较GenMagBio磁珠法、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒方法、苯酚-氯仿法对肺癌血浆循环DNA的提取效果。结果：几种方法中，磁珠法具有最高的提取效率和最低的CV值。结论：磁珠法对肺癌血浆循环DNA具有最好的抽提效果，适合于对小片段DNA的提取。

关键词：肺癌；循环DNA；抽提方法

中图分类号：G642.423 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2018）11-0274-02

循环DNA是存在于人和動物体液中的胞外DNA分子。研究表明，健康人群循环DNA含量极低（约5 μg/L左右）。当机体在炎症、自身免疫病和肿瘤等情况下，其在体液中的含量会大大增加，机制至今仍不明确。因为循环DNA与包括肿瘤在内的一些疾病的产生与发展密切相关，所以其对于肿瘤等疾病的早期诊断和疗效评价具有重要的临床意义。本文分别采用不同的DNA提取方法对肺癌患者的血浆循环DNA进行抽提，其结果报告如下。

一、资料与方法

1.一般资料：以2016年9月—2017年4月的68例肺癌患者为研究对象，其中男43例，女25例，平均年龄（58.2±4.6）岁。

2.方法：所有肺癌患者取静脉血5ml置于EDTA抗凝管中，以3000r/min，离心10min吸取上清血浆于冻存管中，-80℃保存备用。分别参照试剂盒及文献报道方法用血清游离DNA提取试剂盒（北京金麦格生物技术有限公司）、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（Sangon Biotech）、苯酚-氯仿法对肺癌血浆循环DNA进行提取。选取K-ras基因为目标基因，并设计扩增探针（Forward primer：5'-ATTAAAAGGTACTGGTGGAG-3'；Reverse primer：5'-CTATTGTTGGATCATATTCG-3'），对三种抽提方法所得循环DNA样本K-ras基因外显子2基因序列进行PCR扩增。扩增体系为：模板5 μL，扩增引物各2.5 μL ，Taq PCRm mastermix 10 μL。扩增条件为：95 ℃ 4 min；95 ℃ 40 S，43℃ 40 S，72℃ 40 S；40 循环，72 ℃ 3 min。以血清游离DNA提取试剂盒（磁珠法）提取循环DNA模板扩增条带为参照，用BIO-RAD凝胶成像分析系统测定其他两种方法对应扩增条带相对亮度比值，用以比较三种方法对循环DNA的抽提效果。选取同一血浆样本，三种方法分别重复提取5次，进行PCR扩增，比较不同方法扩增条带亮度差异情况，计算各方法的变异系数（CV）。

3.统计学方法：采用SPSS14.0进行，多个样本的比较采用x2检验。

二、结果

1.提取效率的比较。三种提取方法中，磁珠法对应泳道扩增条带亮度最大，SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒方法次之，苯酚-氯仿法最弱（见图1）。SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒方法和苯酚-氯仿法与磁珠法相比，其提取效率分别为67%%和49%（P<0.01）。因此，三种方法中，磁珠法具有最高的提取效率，见表1。

2.三种方法抽提循环DNA重复性比较：通过比较各方法5次PCR扩增条带亮度差异值，磁珠方法的变异系数（CV）小于其他两种方法，说明磁珠法的重复性好，其他两种方法较差（P<0.01），见表1。

三、讨论

外周血循环DNA来自于肿瘤细胞的坏死和脱落，研究表明，肺癌肿瘤患者外周血循环DNA含量显著高于正常人，并且在基因遗传性上与肿瘤原发组织具有高度的一致性[1，2]。提示循环DNA可为肺癌筛查、诊断及预后检测提供微创、方便的标本来源及检测对象。

Szpechcinski等[3]分别对16例健康成人和30例未经治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者循环DNA进行定量研究，结果显示，健康人循环DNA含量为0.9—7.0ng/mL，而NSCLC患者的范围为1.5—50ng/mL，提示非小细胞肺癌患者循环DNA含量大大增加，表明其作为一种肿瘤标志物具有重要意义。也有报道指出循环DNA的定量对于肺癌的分期、化疗监测等有着重要的意义，可作为肿瘤临床治疗的一种依据[4]。

近年来，把基因突变与肺癌的临床治疗相结合，开展EGFR、Kras等肿瘤标记基因个体化用药检测的研究得到快速发展[5，6]。王开云等[7]报道非小细胞肺癌患者血清循环DNA检测EGFR基因突变与肿瘤组织检测具有高度的一致性，对肺癌患者的诊断、筛查和治疗有着重要的意义。

由于血清中循环DNA含量极低，并且具有小片段的特征，因此，在提取时容易丢失，从而影响检测的灵敏度。可靠有效的循环DNA提取方法对研究结果影响很大。本文通过对几种提取方法的提取效果比较显示，磁珠法具有最高的提取效率和最低的CV值，认为磁珠法对乳腺癌患者血清循环DNA的提取效果最好，尤其适用于小片断DNA的提取。

参考文献：

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[3]Szpechcinski A，Dancewicz M，Kopinski P，et al.Real-time PCR quantification of plasma DNA in non-small cell lung cancer patients and healthy controls[J].Eur J Med Res，2009，14 Suppl 4（4）：S237-240.

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[5]崔海忠，肖娜，张永平，陈大贵，唐一通，赵雪红，邵金辉.基于连接酶琼脂糖凝胶电泳的单核苷酸多态性快速检测方法[J].重庆医学，2015，44（10）：1370-1373.

[6]姜北，李晶，巩平，等.非小细胞肺癌患者血清EGFR基因突变循环DNA检测[J].中华肿瘤防治杂志，2014，21（1）：29-33.

[7]王开云，熊敏，徐城林，周云萍.非小细胞肺癌患者血清EGFR基因突变循环DNA检测的临床研究[J].现代肿瘤医学，2015，23（3）：332-334.