植物逆境相关RING finger蛋白的研究进展

田丽 包满珠 张蔚

摘要：锌指蛋白是植物转录因子中的一个大家族，RING finger蛋白属于其中一个分支，具有环状结构域的典型特征结构，在植物生长发育以及响应逆境胁迫等方面起着重要作用。主要综述了RING finger蛋白的结构特点、分类和亚细胞定位，重点概括了RING finger蛋白在参与非生物与生物胁迫耐受性等方面的研究成果，并对其进一步的深入研究进行了展望，为将来利用植物RING finger蛋白基因创造抗逆新种质提供参考。

关键词：RING finger蛋白；锌指；非生物逆境；生物逆境

中图分类号：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）06-0005-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.06.001

Abstract： Zinc finger proteins form a relatively large family of transcription factors in plants. The RING finger proteins represent a subgroup of Zinc finger proteins that contain specialized structures of ring finger domain. Proteins containing RING finger domain（s） were found to play important roles in plant growth and development， as well as responses to stress. Here the structural characteristics， classification and subcellular localization of RING finger proteins were introduced， the recent functional characterization studies of RING finger proteins in response to abiotic and biotic stresses were mainly highlighted， and a prospect for further in-depth research was made， with the hope that a relatively comprehensive reference for the creation of new germplasm with stress resistance using plant RING finger proteins could be provided.

Key words： RING finger proteins； zinc finger； abiotic stress； biotic stress

锌指蛋白最早在1985年由Miller等[1]在非洲爪蟾卵母细胞转录因子TFⅢA中发现，之后根据锌指蛋白基序和结构的不同将其分为9大类：C2H2型、C4型、C6型、C8型、CCCH型、C2HC型、C2HC5型、C3HC4型和C4HC3型（H和C分别代表组氨酸和半胱氨酸）[2]（图1）。RING finger蛋白是锌指蛋白中一个庞大的蛋白家族，近年來植物锌指蛋白报道较多的为C2H2型，而对RING finger型锌指蛋白的研究相对较少。

前人研究表明RING finger蛋白广泛参与植物细胞的各种生理生化过程。例如，Xu等[3]在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中发现RING-H2型基因RIE1是种子发育的重要基因。Schumann等[4]研究发现的过氧化物酶体膜蛋白PEX10（peroxin protein 10）是C3HC4型RING finger蛋白，参与到基质蛋白运输，在过氧化物酶膜与类囊体膜信号传递过程中起到不可缺少的作用。水稻（Oryza sativa L.）中的RING-H2型锌指蛋白OsBIRF1（Oryza sativa L. BTH-induced RING finger protein 1）既能提高植株抗干旱、抗病毒的能力，同时还能促进植株生长，具有多重效应[5]。目前，从植物、动物和微生物中都已分离得到 RING finger蛋白，但许多RING finger 蛋白的功能还不太明晰。本研究主要综述RING finger 蛋白的结构特点、分类以及亚细胞定位，重点概括RING finger 蛋白在植物逆境胁迫应答中的作用，为后续展开更加广泛深入的研究提供参考。

1 RING finger蛋白的结构特点与分类

RING finger domain是1991年从人类基因RING1（Really Interesting New Gene 1）蛋白中新发现富含半胱氨酸的锌指结构域[6]，RING finger也由RING1基因首字母缩写命名得来[7]。RING finger蛋白具有典型的环指结构域（RING finger domain），环指结构域中有富含半胱氨酸序列的基序，概括为Cys-X2-Cys-X9-39-Cys-X1-3-His-X2-3-Cys/His-X2-Cys-X4-48-Cys-X2-Cys，X可以为任意氨基酸[8]，能够与两个Zn2+结合形成典型cross-brace结构[9]（图2）。根据第5位保守氨基酸为半胱氨酸或组氨酸，RING finger蛋白分别对应分为两大类：RING-HC（C3HC4）和RING-H2（C3H2C3）[10]。RING-HC和RING-H2的区别在于共有序列中第5配位是半胱氨酸或是组氨酸。

迄今已在植物中发现了许多RING finger蛋白。利用生物信息学分析的方法，Lim等[11]从水稻中共检索获得488个潜在的RING finger基因，在确定了425个RING finger基因分布的基础上，将其分为RING-H2（281个）、RING-HC（119个）、RING-v（23个）和RING-C2（2个）共计4种类型。Liu等[12]从毛果杨（Populus trichocarpa）中118个候选的C3HC4型RING finger蛋白基因里鉴定出了91个C3HC4型RING finger基因。Alam等[13]从芜菁（Brassica rapa）的基因组中鉴定了715个RING finger蛋白。

2 RING finger蛋白的亚细胞定位

植物RING finger蛋白大多定位于细胞核、细胞质或者细胞膜，如：拟南芥C3H2C3型RING finger蛋白RFI2（Red and Far-red Insensitive 2）[14]、C3HC4型RING finger蛋白DRIP1（DREB2A-INTERACTING PROTEIN 1）[15]、中国野生华东葡萄（V. pseudoreticulata）VpUIRP2蛋白[16]、玉米（Zea mays）ZmRFP1（Oryza sativa cold-inducible）蛋白[17]等。

也有部分蛋白位于内质网等其他地方，如：辣椒（Capsicum annuum）Rma1H1（RING membrane-anchor 1 homolog 1）蛋白[18]、水稻OsHCI1（Oryza sativa heat and cold induced 1）蛋白[19]等（表1）。

3 RING finger蛋白的功能

RING finger蛋白可以发挥转录因子的作用，在植物体内主要是通过与DNA/RNA结合或蛋白互作進行转录调控，部分RING finger蛋白还能起到E3连接酶的作用以调节植物体内蛋白水解等[26]。已知RING finger蛋白广泛参与植物细胞的各种生理生化进程，包括生长发育[27，28]、开花[29]、细胞体内的信号传递[30]、植物与细菌、病原体亲和或不亲和互作以及逆境胁迫应答[31]等过程。而RING finger蛋白在非生物与生物逆境胁迫响应过程中的作用尤为重要。

3.1 RING finger蛋白参与应答非生物胁迫

非生物胁迫主要包括高温、低温、干旱、盐碱、氧化胁迫等，是影响植物分布和农作物生产的主要环境因素。植物在漫长的进化过程中，产生了众多不同的非生物逆境应答与调控方式，发掘关键抗逆基因，解析抗逆机制，不仅可用于植物抗逆性的遗传改良，还将极大地丰富人们对植物非生物逆境胁迫应答的认识，为相关基因在植物抗逆遗传改良中的合理利用提供科学依据和理论基石。近年来很多研究结果表明，RING finger蛋白参与应答各种非生物胁迫（表2）。

3.1.1 RING finger蛋白在渗透胁迫中的作用 渗透胁迫主要是指植物由于环境因素无法获得充足的水分而造成的胁迫。植物体内的生命活动都直接或间接地需要水分的参与，渗透胁迫能够破坏植物细胞的正常离子分布动态平衡，长时间则对植株的生长发育等造成巨大的损害。这里主要概括RING finger蛋白在干旱和盐渗透胁迫中的作用。

至今，已在多个物种中发现RING finger蛋白参与渗透胁迫的应答。Kam等[35]从小麦（Triticum aestivum）中发现锌指蛋白TaRZF70具有4个RING-H2结构。小麦遭受干旱胁迫时，其在叶片中的表达量上升，在根部的表达量却下降，说明TaRZF70的表达具有组织特异性，并推测TaRZF70蛋白的4个RING-H2结构能作用于不同的靶蛋白。沙蒿（Artemisia desertorum）AdZFP1蛋白的N末端具有锚蛋白重复序列区域，C末端具有C3HC4型RING finger结构。干旱处理后，AdZFP1在根、茎、叶等多个器官内的表达量上升。将AdZFP1在烟草植株中异源表达，能增强植株的抗旱性[31]。吴学闯等[23]利用核蛋白筛选系统，从干旱胁迫大豆cDNA文库中筛选出C3HC4型RING finger蛋白基因GmRZFP1。该基因能被干旱、高盐等胁迫诱导表达，表明GmRZFP1涉及多种胁迫相关信号传导途径。Reis等[33]用NaCl处理离体木薯（Manihot esculenta Crantz）叶片时发现MeRZF（Manihot esculenta RZF）表达量增加，推测MeRZF在响应盐胁迫时有着潜在的作用。Cheng等[43]在拟南芥中发现RGLG2能与AtERF53在细胞核内相互作用，通过调节AtERF53（ETHYLENE RESPONSE FACTOR53）的转录活性来负调控干旱胁迫响应。

已知部分RING finger蛋白依赖于ABA途径进行调控。Ko等[32]研究发现XERICO（Greek for ‘drought tolerant）在拟南芥的根、茎和叶等多个器官中有表达。转基因植株在干旱处理下，ABA的生物合成量远远高于野生型植株，同时失水率也要低于野生型。观察叶片气孔状态时还发现，转基因型气孔多数关闭，而野生型多数为开放状态，表明转基因植株通过增加ABA 含量控制叶片气孔的关闭，以减少水分来提高抗旱能力。辣椒中分离出的基因CaRFP1能被NaCl和甘露醇迅速诱导。过量表达CaRFP1的植株在种子萌发期对NaCl和甘露醇的处理很敏感，萌发率显著低于野生型，但在幼苗生长期时渗透胁迫对植株影响变小，推测不同生长期对渗透胁迫的敏感程度不同，这可能是不同生长期对ABA的响应有差异造成，即CaRFP1参与依赖ABA的信号途径[10]。水稻T-DNA突变体osdsg1（Oryza sativa delayed seed germination 1）中，ABA信号相关基因的表达量显著提升。并且，相较于野生型，osdsg1突变体与OsDSG1-RNAi植株更加耐高盐和干旱，推测OsDSG1（Oryza sativa Delayed Seed Germination 1）依赖ABA途径负调控植物抗旱性。

部分RING finger蛋白能够发挥E3泛素连接酶的作用，通过单泛素化或多聚泛素化修饰靶蛋白，调控植物对渗透胁迫的响应。Qin等[15]利用响应干旱胁迫的重要基因DREB2A（The DEHYDRATION-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN2A）筛选拟南芥文库，分离了2个C3HC4型RING finger蛋白DRIP1（DREB2A-INTERACTING PROTEIN 1）和DRIP2。试验证明，DRIP1/DRIP2具有E3连接酶的作用，能在核内与DREB2A相互作用，并能水解DREB2A蛋白。drip1drip2双突变体的耐旱性增强，且干旱胁迫响应基因的表达量也显著上升。研究者推测，DRIP1和DRIP2通过26S蛋白酶泛素化调控DREB2A，对干旱响应起负调控作用。Lee等[18]发现，干旱胁迫下，辣椒Rma1H1基因的表達能被迅速诱导。在拟南芥中异源表达Rma1H1，植株的耐旱性显著增强。酵母双杂交和体外泛素化试验证明，Rma1H1能与水通道蛋白PIP2；1相互作用，并能介导PIP2；1泛素化。研究者推测，Rma1H1及其拟南芥同源基因Rma1（RING membrane-anchor 1）通过抑制PIP2；1的运输，降解PIP2；1蛋白，来下调细胞膜上PIP2；1的水平，从而调节植物抗旱性。目前已在多个物种中发现RING finger蛋白具有E3泛素连接酶活性，能参与特定的泛素化事件。前人报道中多以体外泛素化实验证明目的蛋白是否具有E3连接酶作用，如拟南芥SDIR1（salt-and drought-induced RING finger 1）[36]，水稻OsBIRF1[5]、OsRDCP1（Oryza sativa RING domain-containing protein 1）[37]，玉米ZmRFP1[19]以及烟草NtRHF1（RING-H2 finger gene 1）[38]等，但其是否能在体内同样发挥E3连接酶的作用，以及如何发挥作用还有待进一步研究。

3.1.2 RING finger蛋白在温度胁迫中的作用 极端温度使得植物的细胞膜流动性，膜的脂类成分，光合、呼吸作用，酶活性以及植株的代谢都遭受到损坏，从而影响植株的生长发育。

前人报道中，大部分RING finger蛋白依赖 ABA途径响应低温胁迫。水稻OsCOIN（Oryza sativa cold-inducible）基因的表达受低温、干旱、盐和ABA强烈诱导，OsCOIN的过量表达增强了植株对低温、干旱和盐胁迫的抗性，提高了OsLti6b和OsP5CS等冷胁迫相关基因的表达。其中，OsP5CS（delta1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）是参与脯氨酸合成的一种酶，而脯氨酸对细胞渗透平衡有着重要作用。由此推测OsCOIN 依赖ABA途径，通过调控冷相关基因的表达，增加细胞内脯氨酸含量，从而增强植物对低温、干旱以及盐的耐受性[20]。Jung等[21]发现芜菁BrRZFP1（RING zinc finger protein from Brassica rapa）基因的表达能被低温和ABA迅速诱导。过量表达BrRZFP1的烟草植株对低温、干旱以及盐胁迫的抗性增强。

此外，还有的RING finger蛋白，如拟南芥中的HOS1（high expression of osmoticstress-regulated gene expression 1），通过不依赖ABA的CBF途径在植物抵抗低温胁迫中发挥重要作用。HOS1的编码产物是类似于C3H2C3型的RING finger蛋白，其RING finger domain中第一个氨基酸为亮氨酸，而非半胱氨酸[41，44]。已知CBF类转录因子是调控植物抗寒性的重要节点基因，当植物遭受低温胁迫时，其上游调控因子ICE1（inducer of CBF expression 1）被激活，诱导CBF的表达，而后CBF基因表达产物与下游COR（cold-regulated gene）基因启动子中的CRT/DRE（C-repeat binding factor/dehydration-responsive element binding protein）元件结合， 诱导系列抗冷基因的表达，从而增强植株的抗寒能力[45]。而HOS1蛋白具有E3泛素连接酶的作用。在低温条件下，通过与ICE1相互作用，将 ICE1蛋白降解。体内和体外的实验均证明，HOS1能直接将ICE1泛素化，多泛素化的ICE1蛋白通过26S蛋白酶途径降解。与生化结果一致的是，超量表达HOS1的植株中CBF3以及下游的COR基因表达受到抑制，植株对低温敏感[44]。

除上述响应低温胁迫的RING finger蛋白以外，还有研究发现部分RING finger蛋白响应高温胁迫，但目前报道的文献不多。水稻OsRZFP34基因能被高温和ABA所诱导，异源表达OsRZFP34的拟南芥植株中，很多参与Ca2+、K+和ABA信号传递的基因的表达量上升。并且，用外源ABA处理植株后发现，相较于对照，转基因植株叶片上的气孔张开程度更大。这证明了OsRZFP34是响应高温和ABA的植物调节子。当植物暴露在高温环境中时，OsRZFP34可促进气孔开放，从而提高蒸发速率，利于植株散热[39]。拟南芥RING finger基因AtHHR1被发现参与到了热胁迫响应，实验中对athhr1突变体、athhr1/AtHHR1互补株系及野生型进行45 ℃热胁迫处理，发现athhr1的萌发率、叶绿素及脯氨酸含量高于野生型，而athhr1/AtHHR1株系均低于野生型，且热诱导后拟南芥热信号通路中相关热激蛋白基因在突变体中表达比野生型高，初步证明了AtHHR1基因在拟南芥的热胁迫响应中起负调控作用[40]。

3.2 RING finger蛋白参与应答生物胁迫

生物胁迫主要是指病虫、真菌、细菌以及病毒等对植物的生长发育带来的胁迫。已知RING finger蛋白可以通过调控防御相关基因的表达，激活防御机制来抵御潜在入侵的病原体。水稻基因OsZFP1能响应稻瘟病菌的侵染，其表达水平在稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液接种水稻后缓慢升高，且OsZFP1过表达植株的整体抗稻瘟病能力得到显著提高[46]。Liu等[5]发现的水稻OsBIRF1基因也增强了转基因烟草对烟草花叶病毒及烟草野火病病菌的抗性，转基因植株中PR蛋白以及氧化胁迫相关基因的表达量都有所增加。伍文宪等[47]在本生烟中克隆了C3HC4型RING finger蛋白NbZFP1，其过量表达的烟草植株对烟草花叶病毒的抗性要强于野生型，研究者推测NbZFP1可能通过正调控PR基因的表达来增强抗病性。

许多RING finger蛋白具有E3连接酶活性，可以水解蛋白，从而调控植物对生物胁迫的响应。Hong等[10]发现，超表达辣椒CaRFP1的转基因拟南芥对番茄细菌性斑点病更加敏感，同时还伴随着PR-2、PR-5等抗病相关基因的表达量降低，推测CaRFP1起到E3连接酶的作用，多聚泛素化水解PR蛋白。拟南芥中MIEL1与转录因子MYB30在细胞核中可发生互作，并导致MYB30的降解，从而降低MYB30转录激活的抗病相关基因的表达，抑制植物免疫反应[48]。Yu等[49]发现中国华东葡萄（Vitis pseudoreticulata）中RING finger基因EIRP1（E3 ubiquitin ligase Erysiphe necator-induced RING finger protein 1）参与到病原体防御响应。EIRP1能靶定并泛素化/26S酶蛋白系统水解负调控转录因子VpWRKY11，而转录因子VpWRKY11植物防御中起到负调控的作用，推测EIRP1发挥E3连接酶作用水解 VpWRKY11，从而能增强华东葡萄抗病原体的能力。但同样来源于中国华东葡萄中RING finger基因VpUIRP2是通过响应水杨酸调控增强对白粉病的抗性[16]。

含有保守RING-H2结构域的ATL（Arabidopsis Toxicos en Levadura）家族也是通过E3泛素连接酶活性来介导植物的抗病反应。如拟南芥中的ATL9被发现在免疫反应中调控植株对活体营养型病原物的抗性[24]，而番茄（Solanum tuberosum L.）中的ATL相关基因RFP1（RING-finger protein 1）对于抵抗半活体营养型病原物Phytophthora infestans是必不可少的[50]。Berrocal-Lobo等通过蛋白质泛素化检测，证实了ATL9具有E3连接酶的作用，推测外来病原体如白粉病能激活NADPH氧化酶活性，进而体内产生ROS和MAPK信号，诱导ATL9基因的表达，ATL9则泛素化水解某些抵抗病原的抑制蛋白，同时自身也被快速降解，从而开始防御响应[24]。还有的ATL基因依賴水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）或乙烯（ethylene，ET）等信号途径来调控生物胁迫的响应[51]。如番茄中ATL6能被诱导子诱导表达，其依赖于JA信号途径进行调控[52]。Serrano等[53]发现拟南芥组成型表达ATL2的5个eca（expression constitutiva de ATL2）突变体能响应水杨酸、茉莉酸途径，且存在着较大的不同。与JA-信号途径相关的基因PDF1.2，其表达量只在eca2，eca4中大幅度上升；5个突变体中的防御相关基因ATLs有表达，但SA-信号途径相关基因PR-1只在eca1中高水平表达，其他4个突变体中却没有表达。

4 展望

植物能够适应多种逆境主要是通过改变其基因表达和代谢途径来实现的，研究这些基因表达和功能对提高植物耐逆性具有重要意义[54]，因此植物对逆境胁迫响应机制一直是人们研究的热点。虽然RING finger蛋白响应逆境胁迫的研究已取得了较大进展，但目前有关RING finger蛋白响应逆境的工作多数仍集中在RING finger蛋白基因的结构类型分析、组织及胁迫表达谱、亚细胞定位以及转基因植株的抗性鉴定等方面，RING finger蛋白的调控机制尚未清楚阐明。并且，多数研究以拟南芥和水稻等模式植物为研究对象，由于同源基因在不同物种中的功能有可能出现分化，因此还有更多参与植物生物逆境胁迫响应的RING finger蛋白及其调控机制有待鉴定和研究。

蛋白质泛素化是植物体内蛋白质翻译后重要修饰之一，其中泛素连接酶E3决定底物蛋白的特异性选择。尽管已有许多证据表明一些RING finger 蛋白具有E3泛素连接酶活性，可以调控植物抗逆性，但其底物蛋白是哪些，是如何与底物蛋白相互作用的，是否识别具有相同特点的底物蛋白，E3泛素连接酶能否单泛素化、多泛素化或多聚泛素化修饰这些底物，这些问题还有待解答，深入探究泛素化调控抗逆反应的机制将为提高植物的抗逆性提供新的思路。

随着现代全基因组测序技术的飞速发展，更多物种的全序列将被破译，更多植物的RING finger蛋白将被鉴定。届时利用生物信息分析手段，综合运用功能基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等研究方法，将极大促进和推动RING finger蛋白基因的功能及作用机制研究，并最终加快植物抗逆基因工程育种的进程。

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