高效液相色谱法测食品中的阿斯巴甜新旧国标方法的比对

/ 上海市浦东食品药品检验所

阿斯巴甜(Aspartame)是由天冬氨酸和苯丙氨酸结合而成的缩二氨酸的甲基酯，作为新型甜味剂逐渐被人们所熟悉，其应用范围正逐渐扩大[1]。因为阿斯巴甜中含有苯丙胺酸，不适用于苯丙酮尿症患者，因此采取科学方法准确测定食品中阿斯巴甜的含量至关重要[2]。本文通过对比新旧国标方法的不同之处，分析新国标方法的先进性和科学性。

1 实验原理

阿斯巴甜易溶于水、甲醇和乙醇等极性溶剂而不溶于脂溶性溶剂，将不同分类的样品经不同前处理后用水提取阿斯巴甜，提取的溶液注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性和峰面积比较进行定量[3][4]。

2 前处理方法的改进

2.1 细化样品分类

对于样品的前处理，目的就是尽量提高目标组分的回收率，旧国标GB 22254-2008[5]中，试样的分类只有碳酸饮料类、乳饮料类、浓缩果汁类以及固体饮料，而新的国标方法GB 5009.263-2016（2017-06-23实施）[6]不仅包含了旧国标中的这四种类别，还增加了餐桌调味料、糖果类、乳制品、冷冻饮品、果冻、蔬菜及其制品、水果及其制品、食用菌和藻类、谷物及其制品、焙烤食品、膨化食品、脂肪类乳化制品、可可制品、巧克力及巧克力制品、坚果与籽类、水产及其制品和蛋制品。新国标方法将样品分类更加细化，提取方法更加科学，更加完善。其中，新国标将碳酸饮料、浓缩果汁、固体饮料、餐桌调味料和除胶基糖果以外的其他糖果分为一类，其前处理也较为简便。

2.2 对于样品的制备，增加匀浆步骤

新国标中对于乳制品、冷冻饮品、果冻、蔬菜及其制品、水果及其制品、食用菌和藻类、谷物及其制品、焙烤食品、膨化食品、脂肪类乳化制品、可可制品、巧克力及巧克力制品、坚果与籽类、水产及其制品和蛋制品这些类别的样品，均提出在提取前，用食品加工机按不同的试样与水的质量比进行匀浆，而后称取匀浆试样进行提取测定。新国标增加匀浆的制备步骤，使样品在提取过程中更加快速完全，有效提高目标组分的回收率。

2.3 对果冻中阿斯巴甜的提取单独增加了前处理方法

新国标中细化明确了果冻中阿斯巴甜的提取，果冻基质弹滑，较难用旧国标中的方法充分提取，新国标提出匀浆称样，并加入80%甲醇水溶液，70 ℃水浴加热提取，有效提高目标组分的回收率。

2.4 前处理中增加了正己烷的使用

新国标中，针对胶基糖果、脂肪类乳化制品、巧克力及巧克力制品。坚果与籽类、水产及其制品、蛋制品这些类别的食品，也分别提出加入正己烷进行前处理。旧国标中，此类样品较难用其规定的方法充分提取，杂质干扰也比较严重，新国标中针对胶基类、含脂肪类物质使用正己烷，正己烷是低毒、无色的液体，不溶于水，对胶基类物质有很好的溶解能力，也对脂肪有较好的提取能力。加入正己烷，有效净化样品的基质干扰以及脂肪的残留，对提高目标组分的回收率起了很大的作用。

3 色谱条件的改变

新国标中升高了柱温箱温度，由25 ℃升至30 ℃；流动相增加乙腈-水（20+80）的选择；检测波长也从208 nm改为200 nm。流动相增加乙腈-水（20+80）的选择，可使检测人员在做实验时根据实验分析条件的不同进行优化选择，使色谱条件更加科学、更加完善。试验发现，相同浓度的标准物质，在相同的试验条件下同时测定，200 nm测定时的阿斯巴甜响应值明显大于208 nm测定时阿斯巴甜的响应值，见图1。

图1 在200 nm和208 nm测定时的阿斯巴甜响应值

4 标准溶液系列的制备及有效期

旧国标中阿斯巴甜标准储备液浓度为1.00 mg/mL，置于冰箱保存，有效期为180 d，其标准使用液的系列浓度为 500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、50.0 μg/mL、25.0 μg/mL， 置于冰箱保存， 有效期为60 d。新国标中，将阿斯巴甜标准储备液浓度改为0.5 mg/mL，置于4 ℃左右冰箱保存，有效期为90 d，其标准使用液的系列浓度为 100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、10.0 μg/mL、5.0 μg/mL，置于 4 ℃左右冰箱保存，有效期为30 d。可以看出，旧国标中选取的使用液浓度较大，往往超过样品所含阿斯巴甜浓度的数倍，而新国标中使用液浓度较小，基本涵盖了样品中所含阿斯巴甜的浓度，且有效期的缩短，保证了标准使用液的有效性，更加科学合理。

5 分析结果的表述

新国标增加了“结果保留3位有效数字”的规定，使方法数据结果更加严谨统一。

6 检出限和定量限

旧国标中仅粗略规定样品称样量为5 g、定容体积为25 mL、进样量为20 μL时，方法检出限为0.002 g/kg，定量限为0.006 g/kg，而新国标中，根据样品类别的不同、前处理方法的不同，分别给定了检出限与定量限（详见表1），使方法更加严谨、规范，更具有科学性。

表1 新国标中各类食品中阿斯巴甜的检出限和定量限

7 实验验证

根据新旧国标对前处理的改变，选取改动较大的果冻及胶基糖果进行实验验证。试验步骤如下：选用市售含阿斯巴甜的果冻及胶基糖果-口香糖，分别根据新旧国标的前处理方法进行重复性对比验证。

7.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪— Agilent HPLC配DAD检测器、恒温箱、自动进样器以及Agilent 化学工作站；超声波振荡器；离心机：转速≥4 000 r/min；甲醇；正己烷。

7.2 仪器参考条件

色谱柱—CAPCELL PAK C18 MGⅡ S5，4.6 mmI.D.×250 mm；柱温：30 ℃；流动相：甲醇-水（40+60）；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：200 nm。

7.3 样品前处理

因旧国标中，对果冻以及口香糖没有明确的前处理方法，故选择参照固体饮料的前处理步骤。具体条件如表2所示。

表2 新旧国标样品前处理过程

7.4 标准曲线的绘制

根据样品的实际情况，选取新国标中的浓度范围配制标准曲线，具体浓度见表3。

表3 新国标中采用的标准曲线系列浓度

阿斯巴甜浓度与峰面积呈正相关，其线性回归方程为：y= 55.87 178x，线性相关系数R为0.999 6，线性相关系数R≥0.999时可认为线性良好。

7.5 试验结果及重复性比较

根据上述试验条件，试验结果及重复性比较见表4。

表4 试验结果及重复性

试验证明，新国标中对果冻及胶基糖果（口香糖）前处理方法的改进对阿斯巴甜提取能力有显著提高。

8 结语

新国标对比旧国标，无论是从样品的细化分类、前处理方式方法的改进、色谱条件的优化、标准曲线的有效性和绘制，还是检出限与定量限的改变，都有了更科学、更合理的改进，提高了目标组分的回收率，细化了检出限与定量限，是目前比较完善科学的阿斯巴甜检测方法。

[1]蒋定国，王竹天，杨大进、等.高效液相色谱法测定食品中阿斯巴甜的含量[J].中国卫生检验，2007，17（6）.

[2]宋雁，樊永祥，李宁.阿斯巴甜的安全性评价进展情况[J].中国食品卫生杂志，2010，22（1）：84-87.

[3]吴燕.高效液相色谱同时测定食品中5种添加剂[J].上海预防医学，2008，20（3）：113-115.

[4]刘郁，刘连新，燕传勇，等.高效液相色谱测定茶饮料中的阿斯巴甜含量[J].现代食品科技，2012，28（12）：1810-1812.

[5]中华人民共和国卫生部. GB 22254-2008食品中阿斯巴甜的测定[S].北京：中国标准出版社，2008.

[6]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB 5009.263-2016食品安全国家标准 食品中阿斯巴甜和阿力甜的测定[S]. 北京：中国标准出版社，2016.