H9N2亚型禽流感病毒对鸡的免疫抑制机制

刘青涛， 李 银， 刘 娜,2， 杨 婧， 韩凯凯， 刘宇卓， 赵冬敏， 黄欣梅， 田宇杰,3

(1.江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京 210014; 2.南京农业大学动物医学院, 江苏 南京 210095; 3.贵州大学动物科学学院,贵州 贵阳 550025)

H9N2亚型禽流感病毒(AIVs)，属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属中的A型流感病毒。H9N2 AIVs于1966年首次分离于北美洲的火鸡中[1]，目前在欧亚、北非一些国家的家禽中广泛流行。中国自1992年在鸡群中首次发现H9N2 AIVs后，该病毒在家禽中迅速扩散，目前已发展为流行性病毒，是危害家禽养殖业的主要传染性病原之一[2-5]。近年来，对于H9N2亚型禽流感病毒的研究主要集中在病毒的分离鉴定,遗传进化分析，与H5亚型和H7亚型禽流感病毒的遗传进化关系，跨物种传播风险评估等方面，并取得了一定的进展。但关于H9N2 AIVs对于家禽致病机理方面的研究却很少。

H9N2 AIVs HA蛋白的裂解位点仅有1个或者2个不连续的碱性氨基酸，是一种低致病性的禽流感病毒，H9N2 AIVs感染只能引起鸡的轻微呼吸道症状[6]。但是，H9N2 AIVs感染能够导致大肠杆菌、鸡毒支原体和鸡传染性支气管炎病毒等病原的继发感染，从而引起明显的鸡呼吸道症状或者死亡[7]；H9N2 AIVs感染可以加重一些弱毒活疫苗的临床副反应[8]，值得注意的是，H9N2 AIVs感染还可导致鸡群的疫苗免疫失败。以上现象均说明H9N2 AIVs感染可以诱发鸡的免疫抑制，但是目前对于H9N2 AIVs的免疫抑制机制还不清楚。因此，本研究通过评估H9N2 AIVs感染对于鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗免疫应答的影响，探索H9N2 AIVs的免疫抑制机制，为鸡群中H9N2 AIVs有效防控措施的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

H9N2亚型禽流感病毒1204株由江苏省农业科学院兽医研究所分离并保存。SPF种蛋购自北京梅里亚公司，孵化后养至21日龄用于试验。

1.2 仪器和试剂

淋巴细胞刺激抗原为纯化的鸡新城疫病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV)，由本试验室保存。鸡新城疫病和传染性支气管炎血凝抑制抗原由本试验室保存。鸡外周血淋巴细胞分离试剂盒购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司，鼠抗鸡CD3-FITC荧光抗体、鼠抗鸡CD4-FITC荧光抗体、鼠抗鸡CD8a-FITC荧光抗体为Southern Biotech公司产品，鸡IL-4和IFN-γELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司,检测淋巴细胞增殖活性的CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 SPF鸡的感染与免疫

将21日龄的SPF鸡分为2组，每组6只。病毒感染组通过滴鼻途径感染H9N2 AIVs，感染剂量为每只1×106.0EID50，对照组同时通过滴鼻途径接种PBS。病毒感染组和对照组均在接种后5 d，通过滴鼻途径进行鸡新城疫和传染性支气管炎二联活疫苗的免疫。以上试验均在负压条件下的隔离器内进行。

1.4 血清中血凝抑制抗体的测定

疫苗免疫后第7 d、14 d、21 d，通过翅静脉采血，分离血清，用β微量法测定血清中抗NDV和IBV的血凝抑制(Haemagglutination inhibition, HI)抗体，计算每组HI抗体滴度的平均值。

1.5 鸡外周血T淋巴细胞亚群的流式测定

无菌采集鸡外周EDTA抗凝血，按照鸡淋巴细胞分离试剂盒的程序进行鸡外周血淋巴细胞的分离。将分离的淋巴细胞用PBS洗2遍，并将细胞浓度调整至1 ml 1×106，每200 μl细胞加入鼠抗CD3、CD4和CD8荧光抗体各2 μl进行染色，室温孵育40 min后用PBS洗2遍，最后将细胞用含1%小牛血清的PBS定容至200 μl。24 h内上机测定CD3+CD4+和CD3+CD8+淋巴细胞的比率。

1.6 鸡外周血T淋巴细胞抗原特异性刺激指数的测定

经淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞，并用尼龙毛柱过滤法对T淋巴细胞进行分离。将T淋巴细胞的浓度用RPMI 1640培养基调整为1 ml 2×106，加入96孔板，每孔100 μl，然后在相应的孔中加入含NDV、IBV或者刀豆蛋白A (Concanavalin A, ConA)刺激物的RPMI 1640培养基100 μl，3种刺激物的终含量分别为每孔1×107EID50、1×106EID50和2 μg。同时设含有淋巴细胞但只加入RPMI 1640培养基的空白对照孔，以及无淋巴细胞只加培养液的本底对照孔。将96孔板置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养72 h，然后每孔加入20 μl CCK-8溶液，继续孵育3.5 h，最后在酶标仪上读取D450值。不同刺激物对T细胞的刺激指数( Stimulation index, SI)计算公式为:SI= (刺激物D450值-本底对照D450值)/(空白对照D450值-本底对照D450值)。

1.7 鸡血清中细胞因子的测定

疫苗免疫后第7 d、14 d、21 d，通过翅静脉采血，分离血清，分别用鸡IL-4和IFN-γ ELISA检测试剂盒对血清中的IL-4和IFN-γ进行检测。试验操作按试剂盒说明书进行。

1.8 统计分析

数据采用SPSS13.0统计分析软件进行One-Way ANOVA分析。

2 结 果

2.1 H9N2 AIVs感染对鸡新城疫和传染性支气管炎HI抗体的影响

将对照组与感染组于疫苗免疫后第7 d、14 d和21 d分别进行NDV和IBV血清HI抗体的测定。NDV HI抗体的测定结果(图1)显示，对照组在疫苗免疫后第7 d其NDV的HI抗体滴度为4.3,第14 d和21 d达到较高水平，分别为6.3和6.6。感染组在疫苗免疫后第7 d的NDV HI抗体滴度为3.3，第14 d和21 d的抗体滴度分别为5.6和6.3，抗体水平均低于对照组，但差异不显著。IBV HI抗体的测定结果(图1)显示，对照组在疫苗免疫后第7 d其IBV的HI抗体滴度为3.3，第14 d和21 d达到较高水平，分别为4.3和4.6。感染组在免疫后第7 d、14 d和21 d的抗体滴度均低于对照组，但差异不显著。

图1 鸡血清中鸡新城疫病毒(A)和传染性支气管炎病毒(B)HI抗体的效价Fig.1 HI antibody titers to newcastle disease virus(A) and infectious bronchitis virus(B) vaccine in chicken serum

2.2 H9N2 AIVs感染对鸡外周血中CD4+T淋巴细胞比率和CD8+T淋巴细胞比率的影响

将对照组与感染组于疫苗免疫后第7 d、14 d和21 d分别进行外周血淋巴细胞的分离，并用流式细胞仪进行T淋巴细胞的分型测定。对于CD4+T淋巴细胞的测定结果(图2)显示，对照组在免疫后7 d外周血中CD4+ T淋巴细胞的比率为31.19%，第14 d升至33.84%，第21 d达到高峰，CD4+ T淋巴细胞的比率为37.83%。感染组虽然在疫苗免疫后CD4+ T淋巴细胞比率的变化趋势与对照组相似，但感染组在免疫后第7 d、14 d和21 d的CD4+ T淋巴细胞比率均低于对照组，其中在免疫后第7 d和14 d的差异达到显著水平(P<0.05)。而对于CD8+T淋巴细胞的测定结果(图2)显示，对照组在免疫后7 d外周血中CD8+ T淋巴细胞的比率为17.14%，第14 d升至19.75%，第21 d达到高峰，CD8+ T淋巴细胞的比率为20.92%。感染组在疫苗免疫后第7 d的CD8+ T淋巴细胞比率为17.97%，略高于对照组，而在免疫后第14 d其CD8+ T淋巴细胞比率出现轻微下降，并且显著低于对照组(P< 0.05)，免疫后第21 d感染组的CD8+ T淋巴细胞比率虽然升至18.77%，但仍然显著低于对照组(P<0.05)。

*表示与对照组相比差异达显著水平(P<0.05)。图2 鸡外周血中T淋巴细胞的亚型比率分析Fig.2 Assay of proportion of T lymphocyte sub-populations in peripheral blood of chicken

2.3 H9N2 AIVs感染对鸡外周血T淋巴细胞增殖活性的影响

将对照组与感染组于疫苗免疫后第21 d分别进行外周血T淋巴细胞的分离，分别以ConA、NDV和IBV为刺激物，用CCK-8试剂盒对T淋巴细胞刺激指数(SI)进行测定。结果(图 3)显示，当以有丝分裂原ConA为刺激物时对照组的SI值为1.95，而感染组的SI值为1.80，但对照组与感染组之间差异并不显著。当以NDV或者IBV为免疫刺激物时，对照组的SI值分别为1.9和1.83，而感染组的SI值分别为1.57和1.6，显著低于对照组。

ConA：刀豆蛋白A；NDV：鸡新城疫病毒；IBV：鸡传染性支气管炎病毒。*表示与对照组相比差异达显著水平(P<0.05)。图3 鸡外周血中T淋巴细胞刺激指数分析Fig.3 Assay of stimulation index of T lymphocytes in peripheral blood of chicken

2.4 H9N2 AIVs感染对血清中IL-4和IFN-γ应答水平的影响

将对照组与感染组于疫苗免疫后第7 d、14 d和21 d分别进行血清中细胞因子IL-4和IFN-γ含量的测定。对于IL-4的测定结果(图4)显示，对照组在免疫后7 d血清中IL-4含量为217 pg/ml，第14 d和21 d分别为282 pg/ml和299 pg/ml。感染组在免疫后第7 d、14 d和21 d血清中IL-4含量均低于对照组，但其差异并不显著。IFN-γ的测定结果(图4)显示，对照组在免疫后第7 d和14 d血清中IFN-γ含量分别12.39 pg/ml和13.1 pg/ml，第21 d达到高峰，IFN-γ含量为14.41 pg/ml。感染组在免疫后第7 d、14 d和21 d血清中IFN-γ含量分别为11.02 pg/ml、11.59 pg/ml和13.23 pg/ml，显著低于对照组(P<0.05)。

*表示与对照组相比差异达显著水平(P<0.05)。图4 鸡血清中细胞因子IL-4和IFN-γ水平Fig.4 Assay of cytokines IL-4 and IFN-γ levels in chicken serum

3 讨 论

H9N2 AIVs感染的一个主要危害是引起鸡的免疫抑制，进而导致鸡群的疫苗免疫失败或者继发感染，但是目前对于H9N2 AIVs的免疫抑制机理仍不清楚。因此，本研究通过分析H9N2 AIVs感染对于鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒活疫苗免疫效果的影响，对该病毒感染鸡的免疫抑制机理进行了初步研究。

体液免疫应答和细胞免疫应答是适应性免疫应答的2个主要方面，也是评价疫苗免疫效果的2个主要指标。对于体液免疫应答的研究结果显示，H9N2 AIVs感染鸡后可以降低鸡血清中针对鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的抗体应答，但与对照组相比其差异并不显著。尽管如此，我们认为H9N2 AIVs感染对于疫苗体液免疫应答的影响仍然不应该被忽视。因为在集约化的高密度养殖中，氨气浓度过大和温度变化等环境因素可能会加重H9N2 AIVs感染对于鸡体免疫机能的损害[9-12]，进而促进H9N2 AIVs感染对于疫苗体液免疫应答的抑制作用，造成鸡群的疫苗免疫失败。

由于以前家禽免疫学知识和相关试剂的缺乏，对于家禽疫苗免疫效果的评价主要以体液免疫应答为主，而对于疫苗免疫所产生的细胞免疫应答被人们所忽视。但是，随着技术的发展和研究的不断深入，对于细胞免疫应答在疫苗免疫应答中的作用有了更加深入的认识，特别是目前鸡的相关免疫学试剂已经逐步健全，因此细胞免疫应答已经成为除抗体应答外另一个评价疫苗免疫效果的重要指标[13-14]。而本研究对于鸡外周血T淋巴细胞亚型测定和抗原特异性刺激指数的测定结果显示，H9N2 AIVs感染降低了鸡疫苗免疫后的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞应答反应。

为了进一步研究H9N2 AIVs感染对于疫苗免疫应答的影响，本研究对血清中的IL-4和IFN-γ水平进行了测定。IL-4是一种Th2型细胞因子，可以诱导辅助性T细胞(Th)向Th2方向分化，并且还可以促进B细胞的增殖和抗体分泌，对体液免疫应答具有促进作用[15-17]，其含量是评价体液免疫应答水平的主要指标。本研究结果显示，H9N2 AIVs感染可降低鸡在疫苗免疫后血清中的IL-4水平，说明H9N2 AIVs感染确实在一定程度上降低了鸡的体液免疫应答能力。IFN-γ是一种Th1型细胞因子，能够活化巨噬细胞，可增加多种细胞表面MHC I类和II类分子的表达，并且可以抑制病毒的复制[18-20]，其含量是评价细胞免疫应答水平的主要指标。本研究中，H9N2 AIVs感染明显降低了鸡在新城疫病毒和传染性支气管炎病毒疫苗免疫后血清中的IFN-γ水平，说明H9N2 AIVs感染可显著降低鸡对这些疫苗的细胞免疫应答能力。

病毒感染动物后可以通过多种方式抑制机体的免疫功能。对于H5N1和H7N9亚型禽流感病毒和1918西班牙H1N1大流感病毒的研究发现，病毒感染可引起人、动物血液或者组织中的“炎性因子风暴”，导致体内的免疫应答失衡和免疫器官损伤，造成免疫抑制[21-25]。Smed-Sorensen等对H1N1亚型人季节性流感病毒的研究结果显示，H1N1病毒能够感染树突状细胞，并且使树突状细胞的抗原提呈能力下降[26]。Kodihalli等对H6N1亚型禽流感病毒的研究结果显示，病毒能够感染肺巨噬细胞，抑制巨噬细胞的吞噬功能和杀灭病原微生物[27]。而对H9N2亚型禽流感病毒的研究结果显示，病毒感染可以使鸡脾脏、胸腺、法氏囊中的细胞凋亡率升高，引起法氏囊部分滤泡髓质区内淋巴细胞的轻度减少，但外周血淋巴细胞的数量并未受到病毒感染的影响[28-29]。本研究结果显示H9N2 AIVs感染可以降低鸡的体液免疫应答和细胞免疫应答能力，并且对于细胞免疫应答的抑制作用更加显著，但这是否与病毒感染引起的细胞凋亡或者树突状细胞和巨噬细胞的免疫功能调整、变化相关还需要进一步研究。

参考文献：

[1] HOMME P J E B. Avian influenza virus infections. I. Characteristics of influenza A-turkey-Wisconsin-1966 virus [J]. Avian Dis, 1970, 14:66-74.

[2] 陈伯伦,张泽纪,陈伟斌. 禽流感研究: I 鸡A 型流感病毒分离与血清学初步鉴定[J].中国兽医杂志, 1994，22(10):3-5.

[3] LIU J K, OKAZAKI H, OZAKI Y, et al. H9N2 influenza viruses prevalent in poultry in China are phylogenetically distinct from A/quail/Hong Kong/G1/97 presumed to be the donor of the internal protein genes of the H5N1 Hong Kong/97 virus [J]. Avian Pathol, 2003, 32:551-560.

[4] LIU H X, LIU J, CHENG D, et al. Phylogenetic analysis of the hemagglutinin genes of twenty-six avian influenza viruses of subtype H9N2 isolated from chickens in China during 1996-2001 [J]. Avian Dis, 2003, 47:116-127.

[5] LI C K, YU G, TIAN D, et al. Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in Mainland China[J]. Virology, 2005, 340: 70-83.

[6] ZHIRNOV O P, IKIZLER M R, WRIGHT P F. Cleavage of influenza a virus hemagglutinin in human respiratory epithelium is cell associated and sensitive to exogenous antiproteases [J]. J Virol, 2002, 76: 8682-8689.

[7] 朱明霞,牛玉娟,马海营,等. 规模化肉鸡场常见呼吸道病原体感染状况调查[J]. 山东农业大学学报(自然科学版), 2015, 46(6):861-864.

[8] KAREEM E， HASSAN, AHMED A, et al. Experimental co-infection of infectious bronchitis and low pathogenic avian influenza H9N2 viruses in commercial broiler chickens [J]. Res Vet Sci, 2017, 115: 356-362.

[9] 毕英佐. 发鸡呼吸道堵塞的疾病探究[J]. 北方牧业, 2016(14): 23.

[10] NILI H, ASASI K. Natural cases and an experimental study of H9N2 avian influenza in commercial broiler chickens of Iran [J]. Avian Pathol, 2002, 31: 247-252.

[11] 仇保丰,刘武杰,胡顺林,等. 混合感染的多种亚型禽流感病毒的纯化与鉴定[J]. 微生物学报, 2010, 50(1): 107-112.

[12] ROUSSAN D A, HADDAD R, KHAWALDEH G. Molecular survey of avian respiratory pathogens in commercial broiler chicken flocks with respiratory diseases in Jordan [J]. Poult Sci, 2008, 87: 444-448.

[13] LEI T, YING L, JIN F, et al. Prediction and identification of novel IBV S1 protein derived CTL epitopes in chicken [J]. Vaccine, 2016, 34: 380-386.

[14] MAREK W, ESAM T A, JANA S, et al. Major histocompatibility complex (MHC) class i and MHC class ii proteins: conformational plasticity in antigen presentation [J]. Front Microbiol, 2017, 8: 292.

[15] PAUL W E. Interleukin-4: a prototypic immunoregulatory lymphokine [J]. Blood, 1991, 77: 1859-1870.

[16] MEEK B, SPEIJER D, DE JONG P T, et al. The ocular humoral immuneresponse in health and disease [J]. Prog Retin Eye Res, 2003, 22(3): 391-415.

[17] ARAI K I, LEE F, MIYAJIMA A, et al. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses [J]. Annu Rev Biochem, 1990, 59: 783-836.

[18] LOWENTHAL J W, YORK J J, O NEIL J J, et al.Invivoeffects of chicken IFN-during infection with Eimeria [J]. J Interferon Cytokine Res, 1997, 17 (9): 551-558.

[19] WEINING K C, SCHULTZ U, MUNSTER U, et al. Biological properties of recombinant chicken interferon gamma [J]. Eur J Immunol, 1996, 26: 2440-2447.

[20] SONG K D, LILLEHOJ H S, CHOI K D, et al. Expression and functional characterization of recombinant chicken interferon gamma [J]. Vet Immunol Immunopathol,1997, 58: 321-333.

[21] DE JONG M D, SIMMONS C P, THANH T T, et al. Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia [J]. Nat Med， 2006, 12:1203-1207.

[22] CHEUNG C Y, POON L L, LAU A S, et al. Induction of proinflammatory cytokines in human macrophages by influenza A (H5N1) viruses: a mechanism for the unusual severity of human disease [J]. Lancet, 2002, 360:1831-1837.

[23] TAUBENBERGER J K, REID A H, KRAFFT A E, et al. Initial genetic characterization of the 1918 ‘Spanish’ influenza virus [J]. Science, 1997, 275:1793-1796.

[24] KASH J C, BASLER C F, GARCIA-SASTRE A, et al. Global host immune response: pathogenesis and transcriptional profiling of type A influenza viruses expressing the hemagglutinin and neuraminidase genes from the 1918 pandemic virus [J]. J Virol, 2004, 78:9499-9511.

[25] WATANABE T, KISO M, FUKUYAMA S, et al. Characterization of H7N9 influenza A viruses isolated from humans [J]. Nature, 2013, 501:551-555.

[26] SMED-SORENSEN A, CHALOUNI C, CHATTERJEE B, et al. Influenza A virus infection of human primary dendritic cells impairs their ability to cross-present antigen to CD8 T cells [J]. PLoS Pathog, 2012, 8: e1002572.

[27] KODIHALLI S, SIVANANDAN V, NAGARAJA K V, et al. Effect of avian influenza virus infection on the phagocytic function of systemic phagocytes and pulmonary macrophages of turkeys [J]. Avian Dis, 1994, 38: 93-102.

[28] 谷长勤,罗 玲,胡薛英,等.H9N2亚型禽流感病毒诱导蛋鸡免疫器官细胞凋亡的动态变化[J].中国兽医学报, 2008, 28(1): 12-14.

[29] 袁建琴,高斌战,梁新华. H9亚型禽流感病毒对鸡免疫器官影响的研究试验[J]. 兽药市场指南,2008(12): 39-10.