党参多糖对仔猪小肠黏膜免疫功能的影响

李 成, 尹莉莉, 朱电锋, 何嫣婷, 李曼曼, 丁雪东, 李 玉, 王希春, 吴金节

(安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036)

党参(Codonopsispillosula)是中国传统的补益药材之一，常被作为人参的替代品。植物党参的药用部位是它的干燥根，可用于脾肺气虚、内热消渴、气短心悸、食少便溏等的治疗[1]。党参的主要成分有糖类、生物碱类、甾类、多炔类、苯丙苷类、三萜类、倍半萜类、氨基酸类、挥发油及微量元素[2]。大量研究证明多糖在党参中所占比例最大，为党参重要的活性成分，具有免疫调节、消除自由基、造血、抗疲劳及提高动物生产性能等作用[3-4]。党参能够扶正固本，增强机体免疫能力。刘合军等[5]研究发现，添加有党参的中药复方制剂可增加早期断奶仔猪肠道微生态的多样性，有效提高肠道健康水平。张晓君等[6]研究发现，党参多糖对体液免疫和细胞免疫有一定的促进作用。徐小波等[7]发现饲料中添加党参等中草药可以有效提高育肥性能，改善猪肉品质。石铁男等[8]研究发现党参多糖可以提高肉仔鸡免疫球蛋白G(IgG)含量和肠道分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量，增强肉仔鸡的肠黏膜免疫功能。贾宇等[9]用环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，并饲喂复方党参提取物，一段时间后小鼠的一些免疫指标明显升高，说明复方党参提取物对其有免疫保护作用。

目前关于党参多糖(CPP)的研究主要集中在党参多糖的提取方法和有效成分提纯以及对动物的生长性能、免疫功能的影响方面。而从分子层面上研究党参多糖对仔猪小肠黏膜免疫的影响未见系统报道。本试验在仔猪日粮中添加不同剂量的党参多糖，通过分析仔猪小肠免疫球蛋白A(SIgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)的表达与mRNA相对表达量的变化，进一步探讨党参多糖对仔猪小肠黏膜免疫功能的影响，为今后党参多糖的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

杜×长×大三元杂交仔猪由安徽省青阳县五星畜牧种猪场提供。党参中药材购自安徽亳州济仁堂药业有限公司。TransScript© First-StrandcDNA Synthesis SuperMix、TransStart© Top Green qPCRSuperMix购自北京TransGen生物公司。三氯甲烷、水饱和酚、异戊醇、无水乙醇、乙酸钠、乙酸钾，无锡展望化工公司产品。离心管、TIP头，美国Axygen Biosciences公司产品；BSD-100电热恒温培养箱，上海博讯医疗设备厂产品；微量移液器，德国Eppendorf公司产品；MK3型半自动酶联免疫分析仪、NanoVue plus、PCR仪，美国Thermo公司产品；TGL-18R台式高速离心机，珠海黑马医学仪器有限公司产品；超净工作台，苏州智净净化设备有限公司产品。

1.2 党参多糖的制备

称取6 kg党参，去除杂质，清洗3次，沥干水分。按照料液比1∶10的比例加入60 L 浓度为84%的酒精，提取3次，每次1 h，去除油脂，烘干，称质量。按照料液比1∶20加入纯水，超声波振荡提取40 min，将提取液转移到浓缩罐中进行浓缩，经浓缩、真空冷冻干燥制成粉末。制备完成后采用硫酸苯酚法测得每1 g党参制得0.11 g党参多糖粉末。

1.3 试验动物分组与饲养管理

选取健康的6窝60头1日龄“杜×长×大”三元杂交仔猪，随机分为3组，即对照组、CPP低剂量组、CPP高剂量组。所有仔猪于7日龄开始诱导哺乳仔猪食用代乳料(配方及营养水平见表1)，14日龄开始在3组仔猪中分别饲喂代乳料(对照组)、代乳料+1%(以生药计)CPP(低剂量组)、代乳料+2% CPP(高剂量组)。21日龄断奶，试验期为14 d，常规饮水。消毒及免疫程序严格按照猪场管理方案进行。

表1仔猪代乳料配方及其营养水平

Table1Ingredientsandnutrientlevelsofthemilkreplacerforpiglet

日粮组成含量 营养指标含量全脂奶粉(%)46．00消化能(MJ/kg)14．50脱脂奶粉(%)42．20干物质(%)75．00乳清粉(%)10．50粗蛋白(%)27．90食盐(%)0．30赖氨酸(%)1．61预混料(%)1．00Ca(%)1．04总计100．00P(%)0．89

预混料为每1 kg代乳料提供：VA7 000 IU，VD32 000 IU，VE10 IU，VK32.200 0 mg，VB12.375 0 mg，VB24.800 0 mg，VB60.150 0 mg，VB120.017 5 mg，烟酸(烟酸胺)16.000 0 mg，泛酸钙5.750 0 mg，叶酸0.850 0 mg，生物素0.017 5 mg，赖氨酸0.950 0 mg，抗氧化剂0.045 0 mg，酶制剂1 100.000 0 mg，香味剂45.000 0 mg，甜味剂45.000 0 mg，Mn(MnSO4·H2O)20.180 0 mg，I(KI) 0.400 0 mg，Se(Na2SeO3) 0.350 0 mg。

1.4 样品采集与保存

仔猪28日龄时，各组随机选取6头仔猪剖杀，取十二指肠、空肠3段(前端、中段、末端)、回肠，清除肠内容物。一部分剪碎后液氮保存，用于测定IgA、IgM、IgG的mRNA相对表达量，余下组织保存于4%多聚甲醛中，用于测定SIgA蛋白表达量。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 仔猪小肠各段SIgA、IgM、IgG表达量的测定 制作组织切片，免疫组化法(IHC)检测仔猪小肠各段组织SIgA、IgM及IgG蛋白表达水平，同时设置阴性对照，以PBS替代一抗、二抗。试验结束后采用Olympus显微镜Images图像分析系统对免疫组肠道组织进行拍照，同一组织选择3个视野，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对图片进行分析统计，结果以平均光密度值(Density mean)表示。

1.5.2 仔猪小肠各段IgA、IgM、IgGmRNA相对表达量 依据GenBank中的猪IgA、IgM、IgG及内参18S的序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物(表2)，引物由北京全式金生物公司合成。采用TransScript© First-StrandcDNA Synthesis SuperMix试剂盒，通过RT-PCR法检测IgA、IgM、IgGmRNA相对表达。

1.6 数据处理

表2用于PCR扩增的引物序列

Table2PrimersforPCRamplification

引物 引物序列(5′→3′)扩增片段长度(bp)IgA⁃FTCCAGCCAGTCCGTGAAC122IgA⁃RATTGGAGCCCAGGAGCAGIgG⁃FAAGGAGGAGCAGTTCAACAG86IgG⁃RTTGAACTCCTTCCCGTTCAGIgM⁃FACAGGAGGGAAGTTGAGACG131IgM⁃RGTTTGGGTCTCTAACTGCTC18S⁃FCGGCGACGACCCATTCGAAC9818S⁃RGAATCGAACCCTGATTCCCCGTC

2 结果与分析

2.1 党参多糖对仔猪小肠黏膜SIgA蛋白表达的影响

小肠黏膜SIgA表达情况如图1所示，SIgA表达阳性区域呈现棕黄色，主要分布在肠黏膜上皮肠腔表面以及肠黏膜固有层小肠腺内部，组织经苏木素复染，细胞核呈深蓝色，细胞质为浅蓝色，细胞膜不着色。

表3显示，CPP高剂量组仔猪十二指肠SIgA蛋白表达水平极显著高于对照组(P<0.01)且显著高于低剂量CPP组(P<0.05)，低剂量CPP组仔猪十二指肠SIgA蛋白表达水平高于对照组，差异不显著(P>0.05)；仔猪空肠前段SIgA蛋白表达水平CPP组极显著高于对照组(P<0.01)，两CPP组SIgA蛋白表达水平差异不显著(P>0.05)；CPP高剂量组仔猪空肠中段SIgA蛋白表达水平极显著高于对照(P<0.01)，CPP低剂量组显著高于对照(P<0.05)，且高剂量组显著高于低剂量组(P<0.05)；高剂量CPP组仔猪空肠末段SIgA蛋白表达水平极显著高于对照(P<0.01)，低剂量CPP组与对照差异不显著(P>0.05)，且两CPP组之间无显著差异(P>0.05)；仔猪回肠SIgA蛋白表达量CPP组极显著高于对照(P<0.01)，且CPP高剂量组极显著高于CPP低剂量组(P<0.01)。

2.2 党参多糖对仔猪小肠IgG蛋白表达的影响

由图2可见，IgG蛋白表达阳性区域呈现棕黄色，主要分布在肠黏膜固有层，并有阳性细胞分散或集中分布其中，颜色较深，面积较小。组织经苏木素复染，细胞核呈深蓝色，细胞质为浅蓝色，细胞膜不着色。

仔猪十二指肠IgG蛋白表达水平CPP高剂量组显著高于CPP低剂量组和对照组(P<0.01)，CPP低剂量组与对照组差异不显著(P>0.05)；空肠前段和末段以及回肠IgG蛋白表达水平变化趋势同十二指肠；空肠中段IgG蛋白表达水平，CPP高剂量组显著高于CPP低剂量组(P<0.05)，极显著高于对照组(P<0.01)，CPP低剂量组与对照组差异不显著(P>0.05)(表4)。

2.3 党参多糖对仔猪小肠IgM蛋白表达的影响

图3显示，IgM表达阳性区域呈现棕黄色，主要分布在肠黏膜上皮肠腔表面、小肠腺内部，少量分布在固有层。组织经苏木素复染，细胞核呈深蓝色，细胞质为浅蓝色，细胞膜不着色。

表5表明，仔猪十二指肠IgM蛋白表达水平CPP高剂量组极显著高于CPP低剂量组和对照组(P<0.01)，CPP低剂量组高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。CPP高剂量组仔猪空肠前段IgM蛋白表达水平极显著高于对照组(P<0.01)，显著高于CPP低剂量组(P<0.05)，与对照组比较，CPP低剂量组显著升高(P<0.05)。空肠中段、回肠IgM蛋白表达与空肠前段变化趋势基本一致；空肠末段IgM蛋白表达水平CPP高剂量组极显著高于对照组(P<0.01)，CPP低剂量组显著高于对照组(P<0.05)，两CPP组之间差异不显著(P>0.05)。

A:对照组;B:党参多糖低剂量组;C:党参多糖高剂量组;D:阴性对照;1:十二指肠;2:空肠前段;3:空肠中段;4:空肠末段;5:回肠。图1 党参多糖对仔猪小肠SIgA阳性产物表达的影响(×400)Fig.1 Effect of supplementary Codonopsis pilosula polysaccharide (CPP) on intestinal SIgA positive product in piglets(×400)

表3党参多糖对仔猪小肠SIgA蛋白表达水平的影响

Table3EffectofCPPonSIgAexpressioninintestinaltissuesofpiglets

处理 SIgA蛋白表达水平(以平均光密度值表示)十二指肠空肠前段空肠中段空肠末段回肠对照组0．20±0．02Bb0．19±0．01Bb0．20±0．01Bc0．20±0．02Bb0．20±0C低剂量组0．22±0．01ABb0．22±0．01Aa0．23±0．01ABb0．22±0ABab0．22±0．01B高剂量组0．25±0．01Aa0．24±0．01Aa0．25±0．01Aa0．24±0．01Aa0．24±0．01A

同一列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

A:对照组;B:党参多糖低剂量组;C:党参多糖高剂量组;D:阴性对照;1:十二指肠;2:空肠前段;3:空肠中段;4:空肠末段;5:回肠。图2 党参多糖对仔猪小肠IgG阳性产物表达的影响(×400)Fig.2 Effect of supplementary CPP on intestinal IgG positive product in piglets(×400)

表4CPP对仔猪小肠IgG蛋白表达水平的影响

Table4EffectofCPPonIgGexpressioninintestinaltissuesofpiglets

处理 IgG蛋白表达水平(以平均光密度值表示)十二指肠空肠前段空肠中段空肠末段回肠对照组0．22±0Bb0．21±0．01Bb0．21±0．01Bb0．20±0．01Bb0．21±0．01Bb低剂量组0．23±0．01Bb0．22±0Bb0．23±0．01ABb0．22±0．01Bb0．23±0．01Bb高剂量组0．27±0．01Aa0．26±0．01Aa0．25±0．02Aa0．25±0．11Aa0．26±0．02Aa

同一列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

表5CPP对仔猪小肠组织IgM蛋白表达的影响

Table5EffectofCPPonIgMexpressioninintestinaltissuesofpiglets

处理 IgM蛋白表达水平(以平均光密度值表示)十二指肠空肠前段空肠中段空肠末段回肠对照组0．20±0．01Bb0．19±0．01Bc0．20±0．01Bc0．19±0Bb0．20±0Bc低剂量组0．21±0Bb0．21±0ABb0．22±0．01ABb0．22±0．01ABa0．22±0．01ABb高剂量组0．27±0．01Aa0．24±0．02Aa0．24±0．01Aa0．23±0．02Aa0．23±0．01Aa

同一列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.4 党参多糖对仔猪小肠黏膜IgA mRNA相对表达量的影响

CPP高剂量组十二指肠IgAmRNA相对表达量极显著高于CPP低剂量组和对照组(P<0.01)，CPP低剂量组极显著高于对照组 (P<0.01)，空肠前段、空肠中段、空肠末段、回肠IgAmRNA相对表达量变化趋势与十二指肠一致(表6)。

表6CPP对仔猪小肠组织IgAmRNA相对表达量的影响

Table6EffectofCPPonIgAmRNArelativeexpressioninintestinaltissuesofpiglets

对照 IgAmRNA相对表达量十二指肠空肠前段空肠中段空肠末段回肠对照组1．00±0．15C1．00±0．14C1．00±0．14C1．00±0．01C1．00±0．02C低剂量组1．61±0．03B1．65±0．12B1．70±0．03B1．63±0．12B1．98±0．06B高剂量组2．86±0．19A2．9±0．27A2．91±0．18A2．63±0．15A2．75±0．18A

同一列中不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.5 党参多糖对仔猪小肠黏膜IgG mRNA相对表达量的影响

仔猪十二指肠IgGmRNA相对表达量CPP高剂量组极显著高于对照组(P<0.01)，CPP低剂量组显著高于对照(P<0.05)，且CPP高剂量组显著高于CPP低剂量组 (P<0.05)(表7)。CPP组仔猪空肠前段IgGmRNA相对表达量极显著高于对照组 (P<0.01)，且CPP高剂量组极显著高于CPP低剂量组(P<0.01)。空肠中段IgGmRNA相对表达量变化趋势与空肠前段一致。仔猪空肠末段IgGmRNA相对表达量CPP高剂量组高于CPP低剂量组和对照组，差异极显著(P<0.01)，与对照组相比CPP低剂量组显著升高(P<0.05)。仔猪回肠IgGmRNA相对表达量CPP组极显著高于对照(P<0.01)，CPP高剂量组显著高于CPP低剂量组 (P<0.05)。

表7CPP对仔猪小肠组织IgGmRNA相对表达量的影响

Table7EffectofCPPonIgGmRNArelativeexpressioninintestinaltissuesofpiglets

对照 IgGmRNA相对表达量十二指肠空肠前段空肠中段空肠末段回肠对照组1．00±0．07Bc1．00±0．03C1．00±0．02C1．00±0．08Bc1．00±0．01Bc低剂量组1．19±0．04ABb1．13±0．02B1．28±0．01B1．15±0．03Bb1．29±0．07Ab高剂量组1．41±0．10Aa1．31±0．02A1．56±0．02A1．32±0．03Aa1．50±0．15Aa

同一列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.6 党参多糖对仔猪小肠黏膜IgM mRNA相对表达量的影响

表8显示，仔猪十二指肠IgMmRNA相对表达量CPP组极显著高于对照组(P<0.01)，CPP高剂量组极显著高于CPP低剂量组 (P<0.01)。空肠前段、空肠末段、回肠IgMmRNA相对表达量变化趋势同十二指肠。CPP高剂量组仔猪空肠中段IgMmRNA相对表达量极显著高于CPP低剂量组和对照组 (P<0.01)，CPP低剂量组IgMmRNA相对表达量显著高于对照(P<0.05)。

表8CPP对仔猪小肠组织IgMmRNA相对表达量的影响

Table8EffectofCPPonIgMmRNArelativeexpressioninintestinaltissuesofpiglets

对照 IgMmRNA相对表达量十二指肠空肠前段空肠中段空肠末段回肠对照组1．00±0．13C1．04±0．17C1．02±0．22Bc1．00±0．05C1．00±0．03C低剂量组1．36±0．10B1．41±0．06B1．39±0．05Bb1．44±0．15B1．51±0．05B高剂量组1．85±0．06A2．11±0．10A2．26±0．06Aa2．33±0．10A2．45±0．10A

同一列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

3 讨 论

初生仔猪生长发育迅速，自身免疫系统和消化系统还未完全发育。早期断奶会使仔猪机体产生较大的应激反应，造成食欲不振、消化不良、腹泻等现象[10]。有研究结果表明，哺乳动物的胃肠道黏膜是一种特殊的黏膜免疫器官[11]。断奶应激破坏仔猪肠道黏膜屏障进而造成仔猪肠道免疫功能受损[11-12]。仔猪必须吸收大量养分来增强自身免疫力，在断奶后2周最为明显。因此，仔猪安全度过断奶初期最重要的条件就是其血清中要维持较高的免疫球蛋白水平。

体液免疫是构成机体免疫功能的重要组成部分之一，而免疫球蛋白在体液免疫过程中发挥着重要作用[13]。免疫球蛋白广泛存在于血液、体液内，也存在于外分泌液中，具有结合抗原等生物学效应。其中IgG是血清中的主要抗体，在动物体内发挥抗菌、抗病毒、抗毒素等作用；IgA分为血清型和分泌型，具有维持黏膜上皮结构和功能完整性的作用；IgM是体液免疫中最先出现的免疫球蛋白，在抗感染中起着先锋作用[14]。IgG由脾脏、淋巴结及黏膜等处浆细胞分泌，是机体自然感染和人工主动免疫后所产生的介导体液免疫的主要抗体，在血清中含量最高，持续时间长，主要功能为阻止病菌、毒素及病毒等抗原穿透黏膜进入组织内。

分泌型免疫球蛋白A(SIgA)是由肠道固有层浆细胞产生并分泌至肠腔发挥免疫调节作用的一类蛋白质，具有调控肠道微生物菌群和中和毒素的作用，是肠黏膜重要的效应分子[15]。分泌型免疫球蛋白A与其他免疫因子共同作用还可以阻止病原微生物黏附到肠黏膜并有效抑制黏膜相关炎症反应的发生，维护肠道不受损伤[16]。IgM不是抗感染免疫的主力，但当机体缺乏IgA时，IgM发挥主要作用。在肠黏膜免疫中，以SIgA为主的体液免疫占主导地位，主要作用包括组织病原体粘附、中和病毒、中和毒素及免疫排除[17]。黏膜上皮及固有层内含有大量免疫细胞及免疫分子，通过SIgA和IgM发挥作用,阻止病原微生物在黏膜上皮层定殖[18]。因此以SIgA为主的体液免疫在肠道免疫中起主导作用，是黏膜防御病原体在肠道中的粘附和定殖的第一道防线[19-22]，可以有效保护肠道黏膜免受病原体的入侵和抑制病毒的复制[23]。杨光等[24]在研究党参多糖对小鼠免疫功能的影响时，分别用羊红细胞和卵清蛋白作为抗原注射小鼠并给小鼠灌服党参多糖，发现小鼠抗体水平提高，证实党参多糖对小鼠特异性抗体生成有促进作用。张晓君等[6]研究党参多糖对造血功能的影响时发现，免疫功能低下小鼠在党参多糖的作用下机体内血清溶血素抗体IgM水平提高，一定剂量的党参多糖对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠的迟发型超敏反应也有显著提高，还能抑制环磷酰胺导致的胸腺和脾脏萎缩，说明党参多糖对体液免疫和细胞免疫有一定的促进作用。刘文生等[25]对党参多糖、皂甙的药理作用进行了研究，结果显示党参多糖、皂甙不同程度地提高了小鼠脾脏及胸腺指数，增强了腹腔巨噬细胞的吞噬活性和血清中IgG含量，提示党参多糖及皂甙对小鼠免疫功能具有改善作用。本试验结果显示，党参多糖能提高仔猪小肠组织中SIgA、IgG、IgM蛋白的表达水平以及IgA、IgG、IgMmRNA的相对表达量，增强仔猪的肠道黏膜免疫功能，且代乳料中添加2%党参多糖的作用效果优于添加1%党参多糖的效果。

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