翅果油亚微乳的制备及其抗疲劳活性研究

王晓敏，白冰，李娟，张凯，谢茵，荀波娜，毕小平，*

（1.山西医科大学药学院，山西太原030001；2.山西医科大学第一医院神经内科，山西太原030001；3.山西琪尔康翅果生物制品有限公司，山西太原030001；4.山西大医院，山西太原030001）

翅果油是以翅果经超临界流方法萃取的一种无溶剂残留的绿色、营养丰富的植物油。含有棕搁酸、油酸、亚油酸、亚麻酸4种主要的脂肪酸，且油酸与亚油酸含量比例适合人体的需要模式，具有“天然母乳”美称。此外，它还含有多种人体必需但是须从外界摄取的氨基酸，尤其是维生素E的量居各种油料之冠。研究表明，翅果油具有预防动脉粥样硬化、抗氧化、降血脂、肝细胞再生，促进大脑神经细胞发育，改善免疫功能、改善睡眠、延缓机体衰老等重要保健作用[1-4]。但到目前为止，对其抗疲劳机制的研究却鲜有报道。随着医药工业的快速发展，应用于医药研究的新制剂技术应运而生[5]。亚微乳（submicro emulsion）即以油相、水相和乳化剂制成的粒径为0.1 μm～1 μm的新型乳剂，可供静脉注射，具有安全性好，给药方便，无刺激性，利用度高等优点，临床上广泛用作胃肠外给药载体[6]：而且，亚微乳还可作为新型靶向制剂，选择性作用于病变部位，治疗效果显著[7]。结合亚微乳剂型和翅果油的优势，通过将亚微乳作为药物载体，旨在制备出一种口感好，生物利用度高，吸收好，安全稳定，刺激性小的新型口服乳剂。

疲劳是反应在生理和心理上的一种复杂的机体状态，也是人体适应内外环境刺激的自身防御机制，即机体不能维持预定运动强度致使体力和运动耐力下降的一种生理反应[8]。中医认为，疲劳人群常常呈现为亚健康状态，这种状态下人心理焦虑不安，各项机能明显减退，严重时甚至会出现器质性病变[9-10]。据报道，我国每年有60%～70%的人群处于疲劳的亚健康状态，市场对缓解运动性疲劳产品的需求很大。因此，对缓解体力疲劳的功能性食品的研究与开发，以及从天然植物资源中提取抗疲劳活性成分意义重大。

1 仪器与材料

1.1 材料与试剂

翅果油：山西琪尔康翅果生物制品有限公司；聚甘油脂肪酸酯、硬脂酰乳酸钠、柠檬酸脂肪酸脂：河南奥尼斯特食品有限公司；单硬酯酸甘油酯、蔗糖脂肪酸甘油酯：郑州市食代添骄化工产品有限公司；卵磷脂：郑州四维生物科技有限公司；食用甘油：郑州特正商贸有限公司；山梨酸钾：浙江保圣科技有限公司；全血乳酸（blood lactic acid，BLA）检测试剂盒、血清尿素氮（serum urea nitrogen，BUN）检测试剂盒、肝糖原（hepatic glycogen，LG）检测试剂盒：上海优选生物科技有限公司；实验动物（ICR小鼠）：山西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（晋）2015-0001。

1.2 仪器与设备

紫外-可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；磁力加热搅拌器79-1：常州市华普达教学仪器有限公司；Z326K高速冷冻离心机：德国科学仪器有限公司；MP3002电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；马尔文粒径仪（Nano-Zs90）、Mulitiskam 酶标仪：赛默飞世尔科技有限公司；Vortex-5涡旋混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；离心机：赛默飞世尔科技有限公司；超低温冰箱：赛默飞世尔科技有限公司；数显恒温水浴锅：上海艾牧生物科技有限公司；电动玻璃匀浆机：宁波新芝生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 翅果油亚微乳的制备

2.1.1 工艺流程

2.1.1.1 O相的制备

按照处方量将卵磷脂，单硬脂酸甘油酯溶于翅果油→不断搅拌，70℃水浴加热→为O相。

2.1.1.2 W相的制备

按处方量将聚甘油脂肪酸酯、食品级甘油溶于蒸馏水中→不断搅拌，70℃水浴加热→为W相。

2.1.1.3 乳剂的制备

将W相缓缓加入至O相中，保持两相温度相同→70℃浴加热，持续搅拌→加水至全量，形成果油亚微乳初乳→高压均质机对初乳进行高压均质→制备成粒度均匀的翅果油亚微乳。

2.1.2 评价指标

外观、离心试验、离心稳定性系数Ke值、粒径及ζ电位等作为主要评价指标。对制备出的翅果油亚微乳进行质量评价。

2.1.3 翅果油亚微乳的单因素试验

考察乳化剂的类型及用量符合GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》的乳化剂，助乳化剂的类型及用量：对乳化剂和助乳化剂的组成比进行筛选（乳化剂/助乳化剂质量比为 4∶1、3∶1、2 ∶1及1∶1）；防腐剂类型的筛选（山梨酸钾、苯甲酸钠及尼泊金酯类）；乳化温度（50、60、70、80℃）；乳化方法（干胶法、湿胶法、混合法）等各个因素对翅果油亚微乳的质量的影响，确定翅果油亚微乳的处方组成。

2.1.4 翅果油亚微乳的工艺优化

以“2.1.2”项下的指标为依据，采用正交方案设计优化处方及工艺，选择对配制乳剂有较大影响的4因素为指标，即乳化温度、搅拌时间、乳化方法、转速，每个因素又选择3个水平，采用L9（34）正交试验设计。极差分析，确定其最优处方。对初乳高压均质条件即均质压力、均质次数进行考察。

2.2 动物分组与灌胃

选择小鼠100只，雌性，体重在18 g～22 g之间，适应性喂养3 d，自由摄食与饮水，12 h光照/黑暗交替饲养。对小鼠进行游泳筛选，剔除不会游泳的小鼠后，将100只小鼠随机分为阴性对照组与翅果油低、中、高剂量组及亚微乳组，分别灌胃给予蒸馏水，1.25、2.5、5 mL/kg体重的翅果油及23.7 mL/kg体重（相当于低剂量组载油量）的翅果油亚微乳。

2.3 抗疲劳试验

2.3.1 小鼠负重游泳试验和力竭游泳时间测定

按照2.2项下，将100只小鼠随机分为阴性对照组与翅果油低、中、高剂量组及亚微乳组，阴性对照组灌胃给予蒸馏水，试验组分别灌胃给予翅果油低（1.25 mL/kg）、中（2.5 mL/kg）、高（5 mL/kg）剂量及亚微乳组（23.7 mL/kg），每组10只。对各试验组小鼠连续灌胃30 d，且隔天游泳训练1次，每次20 min～30 min，末次灌胃30 min后，小鼠尾根部负荷5%体重的铅皮，放入大小约（50 cm×50 cm×40 cm）的游泳箱中游泳，水深不少于30 cm，水温（25±0.5）℃，进行负重游泳试验，观察并记录各试验组小鼠从游泳开始至头部沉入水中10 s仍不能返回水面的时间，作为小鼠的力竭游泳时间。并与阴性对照组进行比较，计算其负重游泳时间的延长率[11]。

2.3.2 全血乳酸（BLA）的含量测定及清除率计算

末次灌胃30 min后，将小鼠置于游泳箱（T=30℃）中不负重游泳60 min后将小鼠取出，并迅速擦干。分为2组，其中一组立即摘眼球取血后脱臼处死。将血液置于抗凝管中，离心取血清待测。根据试剂盒要求测定BLA的含量；另一组小鼠泳后置于安静环境中休息60 min后，采用相同的方法测定BLA含量，并计算其清除速率[12]。

计算公式为：

式中：v代表清除速率，mmol/（L·min）；c0代表泳后0 min被测指标的浓度，mmol/L；ct代表泳后t时刻被测指标的浓度，mmol/L；t代表清除时间，min。

2.3.3 血清尿素氮（BUN）的含量测定

小鼠末次灌胃30 min后，将小鼠置于游泳箱（T=30℃）中不负重游泳60 min后将小鼠取出，并迅速擦干。分为2组，其中一组立即摘眼球取血后脱臼处死。将血液置于抗凝管中，离心取血清待测，另一组小鼠泳后置于安静环境中休息60 min后，根据试剂盒操作说明测定各试验组小鼠BUN的含量，并计算其清除速率v1。

2.3.4 肝糖原（LG）的测定

末次灌胃30 min后，使小鼠在温度30℃的水箱中不负重游泳60 min，将小鼠取出擦干，分为2组，一组立即脱臼处死取材。在冰板上迅速取小鼠的肝脏组织，用冰冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，放入液氮中速冻后，取出冻存于-80℃的冰箱中，待测[13]。另一组小鼠泳后置于安静环境中休息60 min后同法取样。按照试剂盒要求的方法测定LG的含量，计算小鼠泳后不同时刻的肝糖原相对储备量。

2.3.5 数据分析

用SPSS17.0统计软件对试验结果进行统计分析。采用单因素方差分析进行均值比较。若方差齐，各组间两两比较用LSD法：方差不齐，各组间两两比较采用Tamhane法。计量资料数据结果以x±s表示，P＜0.05具有统计学差异，P＞0.05表示结果无统计学差异。

3 结果与分析

3.1 翅果油亚微乳的处方筛选结果

3.1.1 单因素试验结果

翅果油亚微乳的油相为翅果油、表面活性剂为单硬脂酸甘油酯，聚甘油脂肪酸酯，卵磷脂的复配乳化剂、助表面活性剂为食品级甘油。处方组成为Km=1∶1，表面活性剂/助表面活性剂∶翅果油质量比为4∶5，即混合乳化剂为4%、翅果油5%、甘油为4%，蒸馏水为76%，山梨酸钾为1%，蔗糖为10%。

3.1.2 正交试验结果

翅果油亚微乳正交直观分析结果见表1。

表1 翅果油亚微乳正交直观分析结果Table 1 Results of the elaeagnus mollis oil submicron-emulsion orthogonal test

Ke值表示离心稳定系数，Ke值越小，表明乳剂越稳定。由表1的极差分析可知，各因素对该处方翅果油亚微乳制备的影响大小顺序为：B＞C＞D＞A：即影响因素依次为：搅拌速度＞温度＞乳化方法＞搅拌时间：各因素以K值最优的制备工艺为A3B2C3D1，按照最优处方制备的翅果油亚微乳的Ke值为0.156，实验方案5的Ke值为0.12，试验结果表明，按照试验5制备的亚微乳更加稳定。因此，综合考虑后制备工艺确定为A3B2C3D1。即以干胶法，在70℃水浴、1 500 r/min转速条件下，搅拌40 min制备得到初乳。

3.1.3 高压乳匀的工艺优化结果

考察高压均质机的均质次数和压力对翅果油亚微乳的影响结果见图1。

由图1A显示，Ke值随均质次数的增加，呈先抑后扬之势，当均质6次时，Ke值最小，图1B显示，粒径随均质次数的增加而降低。综合考虑均质次数对Ke值、粒径的影响，均质6次为宜：图1C显示，Ke值随均质压力的增加而降低，图1D亦显示，粒径随均质压力的增加而降低，当压力达600×105Pa时，粒径降低减缓，故均质压力600×105Pa为宜。

图1 考察高压均质机的均质次数和压力对翅果油亚微乳的影响Fig.1 The homogenization times and pressure of high pressure homogenizer were investigated for the effect of elaeagnus mollis oil submicron-emulsion

3.2 翅果油及其亚微乳对小鼠体重增重的影响

灌胃30天后，采用SPSS17.0统计软件对各试验组小鼠的体重进行分析。结果见表2。

由表2可知，试验前小鼠的初始体重，各试验组间差异均无统计学意义（P＞0.05），表明动物的初始体重在各组间较为均衡，以后每周及试验末期各组间小鼠体重差异均无统计学意义（P＞0.05），表明翅果油各剂量组、翅果油亚微乳组、蒸馏水灌胃对小鼠体重增长无影响。

表2 翅果油及其亚微乳对小鼠增重的影响（n=20）Table 2 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on the body weight in mice（n=20）

3.3 翅果油及其亚微乳对小鼠力竭游泳时间的影响

负重游泳时间可以反映小鼠运动耐力，能够描述运动疲劳的程度。采用SPSS17.0统计软件，对不同组别小鼠的游泳力竭时间及平均延长率数据进行分析。结果见表3。

表3 翅果油及其亚微乳对小鼠负重游泳时间及平均延长率的影响（n=10）Table 3 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on the time of load swimming in mice（n=10）

由表3可知，翅果油中剂量组小鼠，平均负重游泳时间比对照组延长32%，组间具有统计学差异（P＜0.05）：高、低剂量组与阴性对照组相比无统计学差异（P＞0.05）。数据表明翅果油发挥缓解疲劳作用与剂量相关，且中剂量组具有一定的缓解运动体力疲劳之作用。翅果油亚微乳试验组与阴性对照组比较，结果虽不具统计学意义，但结果均高于低、高剂量组和阴性对照组，表明将其制备成亚微乳后可增强吸收，有利于提高其生物利用度，有益于延长游泳时间，表现出一定的缓解体力疲劳之功效。

3.4 小鼠运动后生化指标的测定结果

3.4.1 小鼠运动后BUN的测定结果

采用SPSS17.0统计软件，对不同组别小鼠游泳后即刻（0 min）、游泳后休息60分钟后，血清尿素氮的含量及清除速率测定结果，进行分析。结果见表4。

表4 翅果油及其亚微乳对小鼠BUN含量和清除速率测定结果（n=10）Table 4 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on blood BUN content in mice（n=10）

表4可知：中剂量组小鼠泳后60 min时的BUN含量比对照组显著降低，BUN清除速率是对照组的13.2倍，具有统计学差异（P＜0.05）；高、低剂量组的BUN的含量与对照组相比，清除速率分别为对照组的1.8倍和2.1倍，但均无统计学差异（P＞0.05）。亚微乳组与对照组相比，清除率均略高于低、高剂量组和对照组（P＞0.05），表明将其制备成亚微乳后可增强其吸收。数据表明，翅果油及其亚微乳能够降低小鼠持续高强度运动后体内产生的BUN含量，清除BUN的积累，有助于提升运动能力。

3.4.2 小鼠运动后BLA的测定结果

采用SPSS17.0统计软件，对各试验组小鼠游泳后不同时刻血乳酸的含量测定结果及清除速率，进行分析。分析结果见表5。

由表5分析结果可知：翅果油中剂量组的小鼠，血乳酸的清除速率是对照组的5.5倍，显著高于对照组，具有统计学差异（P＜0.01）；高、低剂量组的清除速率分别是 0.5倍、1.6倍，无统计学差异（P＞0.05）：亚微乳组与对照组相比，无统计学差异（P＞0.05），但清除率均略高于低、高剂量组和对照组，表明将其制备成亚微乳后可增强其吸收。结果表明小鼠体内代谢产物乳酸的消除与翅果油的剂量相关。且中剂量组对乳酸的消除具有高表达。

表5 翅果油及其亚微乳对小鼠BLA含量和清除率测定结果（n=10）Table 5 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on blood LA content in mice（n=10）

3.4.3 小鼠运动后LG的测定结果

依据SPSS17.0统计软件，对不同组别小鼠的肝糖原的含量结果进行分析。结果见表6。

表6 翅果油及其亚微乳对小鼠游泳后肝糖原含量的影响（n=10）Table 6 Effect of elaeagnus mollis oil and its submicron-emulsion on hepatic glycogen content in mice（n=10）

由表6结果看出，与对照组比较，翅果油中剂量组小鼠泳后0 min和泳后休息60 min时，肝糖原的含量分别相对增加36.3%、35.6%，明显高于对照组，具有统计学差异（P＜0.05）；高、低剂量组的肝糖原的含量无统计学差异（P＞0.05）；亚微乳组与对照组相比，LG相对增加量均略高于翅果油低、高剂量组（P＞0.05），表明将其制备成亚微乳后可增强其吸收，提高其生物利用度。结果表明：适量的翅果油通过提高肝糖原的储备，抑制能量消耗，从而具有增进体能和缓解体力疲劳的作用。

4 讨论与结论

基于单因素试验和正交试验设计成功制备出翅果油亚微乳。该剂型不仅可以掩盖翅果油本身滋腻碍胃的口感和油样气味，还具有吸收效果好、口感好、生物利用度高、安全性和靶向性等作用。同时，亚微乳在正常组织中的分布很少，明显减轻药物的不良反应及毒副作用，进而达到高效低毒的特点。这种新剂型为翅果油的进一步开发利用提供了很好的契机，具有一定的市场应用前景。

通过建立小鼠力竭游泳试验模型，并结合肝糖原、乳酸、血清尿素氮等生化指标，研究翅果油及实验室自制亚微乳缓解运动性疲劳的影响。根据《保健食品检验与评价技术》中规定，若1项以上（含1项）运动试验和2项以上（含2项）生化指标为阳性，即可以判断受试物具有缓解体力疲劳的作用。试验结果显示，中剂量翅果油可以显著地延长小鼠负重游泳的时间；增加小鼠肝糖原的储备量，降低剧烈体力劳动后糖原的消耗；对小鼠运动后血清尿素氮的积累具有明显的抑制及清除作用；对小鼠运动后血乳酸具有明显清除作用。我们的研究中由于翅果油亚微乳的载油量为5%（相当于翅果油低剂量组载油量），且小鼠的灌胃容量有限，导致亚微乳无法达到和翅果油中、高剂量相同载油量的灌胃体积。但翅果油亚微乳各项指标均优于翅果油低、高剂量组和阴性对照组，表明将其制备成亚微乳后，可以增加其吸收，提高其生物利用度。

肝糖原是机体重要的能源物质。剧烈运动后葡萄糖耗尽，肝糖原随之分解入血，补充机体能量所需并维持血糖恒定[1]。若肝糖原耗竭，机体供能不足，就会产生疲劳[14]。所以增加肝糖原储备，有利于延缓疲劳发生。本文结果表明，翅果油可能是通过提高运动后小鼠肝糖原的储备，为机体提供更多的运动耐力能量来发挥抗疲劳作用。乳酸是机体通过葡萄糖的无氧糖酵解产生的代谢终产物[15]。剧烈运动时，机体以无氧呼吸为主，其代谢产物乳酸会破坏酸碱平衡，使水盐代谢紊乱，进而引起疲劳[13]。乳酸积聚越多，疲劳感越严重，乳酸清除越彻底，疲劳恢复越快[16]。研究结果表明，翅果油可能是通过加速运动后小鼠血乳酸的清除，有利于其疲劳的恢复，从而缓解其疲劳感。血尿素氮是评价机体运动能力、负荷能力较为灵敏的重要指标[17]。机体高强度运动后，糖与脂肪的分解代谢，不足以提供足够的能量时，蛋白质会分解，其代谢产物为尿素氮，它含量越高，表明疲劳越严重。本试验结果表明，翅果油可能是通过抑制蛋白质的分解，减少运动后小鼠血清尿素氮的积累，增强运动耐力从而缓解疲劳作用。

本文对翅果油及其亚微乳缓解运动性疲劳及机制进行了初步探讨，然而，翅果油中功效成分复杂多样，富含不饱和脂肪酸、维生素E、植物甾醇和蛋白质等，但其抗疲劳作用究竟是单一组分还是多种化合物的综合作用结果有待于进一步研究。

本文制备出了一种安全性好，口感俱佳的翅果油亚微乳。该翅果油能显著延长小鼠负重游泳时间，同时降低小鼠运动后血乳酸、血清尿素氮的蓄积，提高肝糖原的储备，具有一定的缓解运动性疲劳作用。本研究对于翅果油进一步研发新型的功能产品提供一种新的思路，具有一定的实际应用价值及应用前景。

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