阿维菌素、埃比菌素的残留检测

陈吉香，谢体波，冯才伟

（贵州勤邦食品安全科学技术有限公司，贵州贵阳550009）

阿维菌素是一种高效、广谱的抗生素类药物，由链霉菌中灰色链霉菌发酵产生，由一组大环内酯类化合物组成。阿维菌素类药物主要包括阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素等物质[1]，是一种优良的新型农畜两用抗生素[2-3]，其作用机制独特，使用方便，被誉为近几十年来抗寄生虫药物研究进展的重大突破。该物质杀虫活性强，抗菌面广[4]，广泛用于蔬菜、水果、烟草等作物。但在动物体内残留时间长，被世界卫生组织列为高毒化合物[5-6]。具有神经毒性和免疫毒性，多见为中枢神经系统损害[7-8]，大剂量可引起人或动物昏迷乃至死亡[9]。

目前，阿维菌素类药物在蔬菜中的残留分析方法主要是液相色谱法和液相色谱—串联质谱法等仪器分析方法，但仪器法样品前处理复杂，检测时间长，仪器昂贵，成本较高[10-12]。

该研究采用间接竞争酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorlent assay，ELISA）方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，留的阿维菌素类药物与酶标板上的偶联抗原竞争阿维菌素抗体，加入酶标二抗后，用 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-Tetrarnethy lbenzidinep，TMB）底物显色，终止液终止反应，用酶标仪在450 nm处测定吸光度，样本吸光度值与其所含阿维菌素类药物残留量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出阿维菌素类药物残留含量。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

新鲜蔬菜：白菜、胡萝卜；干菜和高淀粉含量样品：干洋葱、土豆；均属市售。

阿维菌素标准品（纯度≥99%）、埃比菌素标准品（纯度≥99%）：上海安谱科学仪器有限公司；甲醇、乙腈、无水硫酸钠、碱性氧化铝（100目～200目）、正己烷，均为分析纯：贵阳诚承化工设备有限公司；去离子水；阿维菌素类药物快速检测试剂盒产品[全套产品包括：96孔酶标板1块（包被有偶联抗原）、标准品6瓶：1 mL/瓶（0、0.5 、1.5、4.5 、13.5、40.5 μg/mL）、高浓度标准品：1 mL/瓶（1 mg/L）、酶标二抗 12 mL（红色帽）、抗体工作液10 mL（绿色帽）、底物液A液7 mL（白色帽）、底物液B液7 mL（红色帽）、终止液7 mL（黄色帽）、20×浓缩洗涤液40 mL（透明帽）、2×浓缩复溶液50 mL（蓝色帽）]：北京勤邦生物技术有限公司。

配液1：复溶工作液

用去离子水将2×浓缩复溶液1∶1（体积比）进行稀释（1份+1份去离子水）用于样本的复溶。

配液2：洗涤工作液

用去离子水将20×浓缩洗涤液1∶19（体积比）进行稀释（1份+19份去离子水）用于酶标板的洗涤。

1.1.2 仪器与设备

S7-360微孔板酶标仪（450/630 nm）：上海科华生物工程股份有限公司；EV311旋转蒸发仪/Kwin6800氮气吹干装置：北京莱伯泰科仪器有限公司；FJ-200均质器：常州国宇仪器制造有限公司；HY-2振荡器：常州国华电器有限公司；GZ-21M离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；QL-901涡旋仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；JY2002天平（感量0.01 g）：上海恒平科学仪器有限公司；10 mL刻度移液管、洗耳球、10 mL玻璃试管、2、50mL聚苯乙烯离心管：贵阳诚承化工设备有限公司；单道 20 μL～200 μL 微量移液器、100 μL～1 000 μL微量移液器、多道250 μL微量移液器：赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

1.2.1.1 新鲜蔬菜：白菜、胡萝卜

1）用均质器均质蔬菜样本：

2）称取（1.0±0.05）g均质后的组织样本至 50 mL聚苯乙烯离心管中，加入5 mL正己烷，用振荡器震动10 min，3 000 g以上，15℃（59℉）离心10 min；

3）取1 mL上层清液至10 mL洁净干燥玻璃试管中，于50℃～60℃（122℉～140℉）水浴氮气流下吹干；

4）加入1 mL复溶工作液（见配液1），用涡旋仪涡动30 s以上，超声10 min，再用涡旋仪涡动30 s，混匀：

5）取 20 μL 用于分析。

1.2.1.2 样品（干洋葱、土豆）

1）用均质器均质蔬菜样本；

2）称取（1.0±0.05）g均质后的组织样本至 50 mL聚苯乙烯离心管中，加入6 mL去离子水，充分混匀，再加入5 mL正己烷，用振荡器震动10 min，3 000 g以上，15℃（59℉）离心10 min；

3）取1 mL上层清液至10 mL洁净干燥玻璃试管中，于50℃～60℃（122℉～140℉）水浴氮气流下吹干；

4）加入1 mL复溶工作液，必须用涡旋仪涡动30 s以上，超声10 min，再用涡旋仪涡动30 s，混匀；

5）取 20 μL 用于分析。

1.2.2 样品检测

1）将所需试剂从冷藏环境中取出，使用之前将模具内所有试剂与酶标板放实验桌上回温至室温（20℃～25℃/68℉～77℉），将每种液体试剂摇匀；

2）取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回铝箔袋重新真空密封，保存于2℃～8℃（36℉～46℉）环境中；

3）编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置；

4）加标准品/样本和抗体工作液：加入标准品/样本20 μL到对应的微孔中，然后加入抗体工作液80 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃（98.6℉）避光环境中反应30 min；

5）洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液（见配液2）250 μL/孔，充分洗涤4次～5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破）；

6）加酶标二抗：加入酶标二抗 100 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃（98.6℉）避光环境中反应30 min，取出重复洗板步骤5；

7）显色：加入底物液 A 液 50 μL/孔，再加入底物液B液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃（98.6℉）避光环境中显色15 min；

8）测定：加入终止液 50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处测定每孔OD值（在5 min内读完）。

2 试剂盒相关指标检测方法

分别对试剂盒的特异性、检测限、精密度、准确度进行试验，并将其中检测限、精密度和准确度与仪器方法检测的检测限、精密度和准确度进行对比。

2.1 线性关系

标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

式中：B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；B0为0 μg/L标准溶液的平均吸光度值。

分别测定阿维菌素和埃比菌素 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/kg 6个浓度的标准液的吸光度值（A）。求出其浓度对数值（y）和对应浓度的百分吸光率（x）的线性关系。结果显示如表1。

表1 药物标准曲线方程Table 1 Equation of standard curve of drugs

阿维菌素标准曲线回归方程为：y=-2.210x+1.524，相关系数为R2=0.999，埃比菌素中标准曲线回归方程为：y=-0.750x+0.273，相关系数为R2=0.999，说明试剂盒线性关系良好。

将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中阿维菌素类药物的实际浓度。其中，新鲜蔬菜样本、干菜和高淀粉样本的稀释倍数均为5倍。

2.2 试剂盒特异性的测定结果

特异性用交叉反应率来表示，交叉反应率是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。交叉反应率小，可证明抗体的特异性高。选择与阿维菌素类似结构和类似功能的3种药物，将不同浓度的阿维菌素类似物，替代阿维菌素标准溶液，测定其标准曲线，并计算IC50抑制浓度，并根据各药物的IC50抑制浓度计算交叉反应率。结果显示如表2。

表2 交叉反应率Table 2 Cross response rate

该酶联免疫试剂盒对阿维菌素类药物类似物生物交叉反应率均较低，具有良好的特异性。

2.3 试剂盒检测限的测定结果

分别对20份白菜、胡萝卜、干洋葱、土豆样本进行检测，计算阿维菌素类药物的浓度，测定结果的平均值加上3倍标准差为试剂盒的实际样品的最低检测限。结果显示如表3，该酶联免疫试剂盒对白菜、胡萝卜、干洋葱、土豆中阿维菌素和埃比菌素的检测限均为 3 μg/kg。

表3 试剂盒最低检测限Table 3 Minimum detection limit of kit

续表3 试剂盒最低检测限Continue table 3 Minimum detection limit of kit

表4 试剂盒准确度检测结果Table 4 Accuracy test results of kit%

表5 试剂盒精密度检测结果Table 5 Precision test results of kit%

2.4 试剂盒精密度和准确度测定结果

精密度又称可重复性，反应测定方法对某一特定样品多次测定所得结果的重复程度，这是评价酶联免疫试剂盒质量的最基本参数，常用变异系数表示。准确度是指测定值与真实值间的符合程度，试剂盒的准确度常用回收率表示。

在检测为阴性的白菜、胡萝卜、干洋葱、土豆样本中分别添加 5、10 μg/kg 和 20 μg/kg 阿维菌素、埃比菌素，每种样品、每个浓度各6个平行，用试剂盒提供的操作方法提取测定。分别测定计算样品的回收率及变异系数。结果显示如表4、表5，对于阿维菌素，4种样品平均回收率均在92.0%～99.6%之间，对于埃比菌素，4种样品平均回收率均在91.3%～100.1%之间，批内和批间变异系数均小于10%，说明该酶联免疫试剂盒具备较高的精密度和准确度。

表6 试剂盒与仪器检测方法比较Table 6 Comparison of kit and instrument detection method

2.5 试剂盒与仪器方法检测结果比较

随机抽取市场上售卖的白菜、胡萝卜、干洋葱、土豆样本各80份，分别用试剂盒和仪器方法进行检测。仪器方法参考GB 23200.20-2016《食品安全国家标准食品中阿维菌素残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》。

仪器方法中阿维菌素与埃比菌素的检测限为5 μg/kg，以此为阳性判定线，高于或等于阳性判定线的值以实际值表示。结果显示如表6，公司自主研制的阿维菌素三合一酶联免疫试剂盒检测结果与仪器检测结果相吻合，表明这试剂盒的准确度达到国家标准检测水平。

3 结论与讨论

本文对自主研发的阿维菌素三合一酶联免疫试剂盒的特异性、检测限、精密度和准确度进行研究，并对白菜、胡萝卜、干洋葱、土豆4种样品中阿维菌素类药物的残留量进行检测，将其检测结果与仪器方法相比较。结果表明，阿维菌素三合一酶联免疫试剂盒特异性强、灵敏度高，对白菜、胡萝卜、干洋葱、土豆4种样品的最低检测限为3 μg/kg：阿维菌素测定时4种样品平均回收率在92.0%～99.6%之间，埃比菌素测定时4种样品平均回收率在91.3%～100.1%之间，批内和批间变异系数均小于10%，说明该酶联免疫试剂盒具备较高的精密度和准确度；其对市售白菜、胡萝卜、干洋葱、土豆4种样品的检测结果与仪器检测结果相吻合，说明该试剂盒达到国家标准检测水平，且分析周期短，样品前处理方法简单，操作方便，检测设备投入少，耗能低，可实现对蔬菜中残留阿维菌素类药物的快速检测。

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