基于离体培养酸枣种子萌发及幼苗生长对盐胁迫的响应研究

杨彦强，卢登洋，闫芬芬，张乔乔，吴翠云

塔里木大学植物科学学院，兵团南疆特色果树高效优质栽培与深加工国家地方联合工程实验室，新疆阿拉尔 843300

近十余年，枣产业成为新疆农业支柱产业之一[1]。但新疆枣主要分布在环塔里木盆地的盐碱土地中。因此盐胁迫是制约新疆枣产业进一步发展的重要因素。酸枣作为枣栽培的砧木，其耐盐性强弱直接影响枣的产量和品质。酸枣是异花授粉植物，利用种子繁殖后代性状会广泛分离，不同个体因基因型不同，其抗逆性表现有显著差异。且植株个体因发育阶段以及环境条件等因素的影响,在不同的生长条件下可能有不同的试验结果。因此筛选耐盐砧木成为解决这一问题的重要方法。目前国内外对酸枣的研究主要集中在抗性差异方面[2-5]及利用根孽苗进行盐碱胁迫筛选[6]。主要采用大田栽培、无土栽培等方法，此类方法因土壤或基质的缓冲性和本身的差异性，可能增大试验误差。本研究拟通过离体培养方式，开展不同盐浓度胁迫对酸枣种子萌发的影响研究，筛选耐盐性酸枣单株，为耐盐性酸枣砧木的筛选奠定基础，进而解决新疆盐碱土壤限制枣产业发展的问题。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料是采集于山西省的野生成熟酸枣果实。自然阴干后,置室内干藏，脱去果皮和种皮，取出种仁备用。

1.2 试验方法

1.2.1 盐胁迫条件下的酸枣种子萌发试验

挑选饱满无损伤的去核酸枣种仁，用盐浓度分别为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的水溶液浸泡12 h，无菌水冲洗2～3次，于无菌室内75%酒精浸泡20 s，2%次氯酸钠震荡消毒20 min，1%次氯酸钠震荡12 min，无菌水冲洗2～3遍，剥去种皮后分别接种于盐浓度为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的MS培养基中，每处理接种30粒种子。接种后置于25±2℃、2500 Lx光照强度、14 h光照10 h黑暗条件下培养。接种后每天观察记录种子萌发数。并筛选离体培养条件下酸枣种子萌发的耐盐性阈值。

1.2.2 酸枣离体培养幼苗的盐胁迫试验

1.2.2.1 酸枣离体培养幼苗的获取

备用酸枣种仁用自来水浸泡12 h 后于接种室内用无菌水冲洗2～3 次，75%酒精浸泡20 秒，2%次氯酸钠震荡消毒20 min，1%次氯酸钠震荡消毒处理12 min，再用无菌水冲洗2～3 遍，剥去种皮后接种于MS 培养基，置于25±2℃、2 500 Lx光照强度、14 h 光照10 h 黑暗条件下培养，以获取用于盐胁迫处理的幼苗。

1.2.2.2 酸枣幼苗盐胁迫试验方案

待酸枣幼苗生长20 d后，将幼苗转接到添加不同浓度NaCI 胁迫的MS 培养基中，盐胁迫浓度分别为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，每个处理17个单株。转接后连续调查酸枣幼苗株高、叶片数、盐害等级、死亡株数，计算株高增长变化、叶片增长变化、盐害等级、死亡率，并确定离体培养酸枣幼苗的耐盐性阈值（以死亡率超过50%为离体培养幼苗耐盐阈值筛选标准）。

1.2.3 酸枣盐敏感单株及耐盐单株的筛选

根据筛选得到的离体培养酸枣幼苗的耐盐性阈值，确定酸枣离体培养幼苗盐敏感单株及耐盐单株筛选的盐浓度。每隔10 d观察记录植株生长变化情况及盐害等级,从而确定酸枣离体培养幼苗盐敏感单株及耐盐单株的筛选所需盐胁迫时间。

1.2.4 指标测定

1.2.4.1 种子萌发率的统计及耐盐阈值的确定

于接种后第2 d开始逐日调查各处理酸枣种子萌发数( 以胚根长度超过种子长度的1/2为发芽标准），并计算萌发率、发芽势、种子萌发耐盐阈值。

萌发率=萌发种子数/供试种子数×100%[7]。

发芽势=发芽进程当日发芽最多种子发芽数/供试种子数×100%。

以胁迫发芽率比对照发芽率下降50%为标准计算耐盐阈值[8]。

1.2.4.2 盐害等级调查

每隔3～4 d 观察幼苗变化，将幼苗从正常生长到幼苗死亡平均分为6个等级。

0级：植株正常

1级：叶片有轻微干枯焦黑卷曲

2级：叶片超过一半受害

3级：叶片超过75%受害或植株轻微萎蔫或侧枝生长

4级：叶片脱落或植株顶端干枯或植株萎蔫

5级：植株死亡

1.2.4.3 幼苗叶片和株高测定

每隔3～4 d调查一次叶片数和株高（幼苗子叶至生长点的高度），计算幼苗叶和株高的增长量。叶片增长量以每次调查数量减去接种时初始叶片数，株高增长量以每次调查幼苗高度减去初始高度。

1.2.5 数据统计与分析

使用Excel2010 软件对调查数据进行统计分析，DPS方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度盐胁迫对离体培养酸枣种子萌发的影响

发芽率是衡量种子活力的最重要指标。由图1可知，随着盐胁迫浓度的增加，离体培养酸枣种子的萌发率显著降低，0.4%、0.6%、0.8%盐浓度处理对酸枣种子萌发的抑制作用显著高于CK 和0.2%，且种子开始萌发时间较CK 和0.2%处理延后2 d。各处理种子分别于接种后6～8 d停止发芽，最高萌发率依次为90.63%、71.43%、25.00%、21.21%、13.51%。发芽势依次为50.0%、22.86%、10.71%、15.15%、5.41%。萌发率越小，说明酸枣种子受盐胁迫抑制越重。以胁迫发芽率比对照发芽率下降50%为耐盐阈值标准，说明0.4%的盐浓度为酸枣离体培养种仁萌发的耐盐阈值。

图1 盐胁迫对离体培养酸枣种子萌发的影响（%）

2.2 不同浓度盐胁迫对离体培养酸枣幼苗株高变化的影响

由图2可知，在盐胁迫处理前8 d，离体培养酸枣幼苗株高增长量在各浓度处理间无显著性差异，胁迫处理16 d之后，0.8%盐浓度与CK和0.2%盐浓度间有显著差异，其他各处理间均无显著性差异，胁迫第26 d 时，0.8%盐浓度处理酸枣幼苗株高极显著低于0.2%和CK（见表1）。各浓度幼苗株高变化的标准差随胁迫时间的延长在整体上呈上升趋势，说明胁迫时间越长，相同处理下，酸枣幼苗单株间株高变化差异越大，可能是因为酸枣幼苗个体基因型差异所致，不同个体的耐盐性的强弱表现出差异性。

图2 盐胁迫对离体培养酸枣株高变化的影响

表1 盐胁迫条件下离体培养酸枣幼苗株高的变化（cm）

2.3 不同浓度盐胁迫对离体培养酸枣幼苗叶片生长的影响

由图3可知，离体培养酸枣幼苗在不同盐浓度胁迫下，幼苗叶片增长量均呈上升趋势，0.2%盐浓度条件下的酸枣幼苗叶片增长量在胁迫2～26 d 内均高于其他各浓度。在胁迫26 d 时，CK酸枣叶片增长量分别是0.2%、0.4%、0.6%、0.8%盐浓度的 0.82 倍、0.92 倍、1.12 倍、1.32 倍。但各浓度处理间均无显著性差异。

图3 盐胁迫对离体培养酸枣叶片变化的影响

2.4 不同浓度盐胁迫对离体培养酸枣幼苗盐害指数的影响

不同盐浓度胁迫处理后酸枣幼苗盐害指数变化情况见图4，随着培养基中NaCl浓度的升高，酸枣幼苗盐害指数逐渐上升。其中，0.6%和0.8%盐浓度条件下，盐害指数分别达84.71%和91.25%，指数变化值达到77.65%和88.75%，0.2%和0.4%浓度胁迫条件下盐害指数变化分别为49.41%和54.67%，而对照条件下，酸枣幼苗的盐害指数和指数变化分别为41.25%和40.00%。酸枣幼苗转接到不同盐胁迫浓度培养基，盐胁迫前7 d，各处理的酸枣幼苗盐害指数均表现为快速增高。胁迫7 d后，各浓度酸枣幼苗盐害指数仍在升高，且盐浓度越高增长越快。酸枣幼苗在胁迫21 d后各浓度幼苗盐害指数出现明显分离。0.6%和0.8%浓度处理酸枣幼苗盐害指数显著高于CK、0.2%、0.4%浓度处理。

图4 盐胁迫条件下离体培养酸枣幼苗盐害指数变化

2.5 离体培养酸枣幼苗盐敏感性和耐盐性单株筛选

由表2可知，离体培养酸枣幼苗在不同盐浓度胁迫45 d 内幼苗的死亡率各浓度间具有较大差异。CK、0.2%盐浓度酸枣幼苗在盐胁迫下直到第45 d 幼苗死亡率均为0，而0.4%、0.6%、0.8%盐浓度处理下幼苗出现死亡的时间依次为胁迫第40 d、第30 d、第25 d。0.6%盐浓度酸枣幼苗在盐胁迫第45 d 幼苗死亡率为52.94%。以死亡率超过50%为离体培养幼苗耐盐阈值筛选标准，由此得出离体培养酸枣幼苗盐胁迫阈值为0.6%。为更准确筛选出离体培养酸枣幼苗盐敏感性和耐盐性单株，因此确定在0.8%浓度盐胁迫培养基中筛选耐盐单株，在0.4%浓度盐胁迫培养基中筛选敏感单株。

0.8%、0.4%盐浓度下离体培养酸枣幼苗各等级所占比例见表3、表4。随着胁迫时间的增加酸枣幼苗的盐害程度越重。在0.8%盐浓度胁迫时间在40～60 d内，4级盐害酸枣单株数量最多，分别为达40.46%、38.93%、40.46%，可将评价筛选耐盐性酸枣幼苗的胁迫时间确定为40 d。本试验在0.8%浓度胁迫培养基共转接131株离体培养的酸枣幼苗，通过观察记录叶片变化、株高变化、生长情况和盐害症状。在胁迫第42 d筛选出19株耐盐单株。

酸枣幼苗在0.4%盐浓度胁下，随着胁迫时间的增加，4 级和5 级幼苗所占比例相应增加。在0.4%盐浓度胁迫下酸枣幼苗0 级株率均为0。敏感单株主要在第2 级和第3 级中筛选。酸枣幼苗在胁迫30 d时第2级株率大幅度减少而第3级株率开始减少。胁迫40 d后第4级和第5级所占株率开始快速增加。可将评价筛选盐敏感性酸枣幼苗的胁迫时间确定为30 d。本研究在0.4%浓度胁迫培养基中共转接63株离体培养酸枣幼苗，通过观察记录叶片变化、株高变化、生长情况和盐害症状。在胁迫第30 d筛选出6株盐敏感单株。

表2 离体培养酸枣幼苗死亡率变化(%)

表3 0.8%盐浓度下离体培养酸枣幼苗各等级所占比例（%）

表4 0.4%盐浓度下离体培养酸枣幼苗各等级所占比例（%）

3 讨论与结论

3.1 讨论

张国伟等[10]研究认为，地上部分、株高等指标可作为棉花苗期耐盐的鉴定指标。本研究表明，不同盐浓度的处理均会对离体培养酸枣幼苗的株高、叶片、盐害等级和酸枣种子萌发产生影响，并随着胁迫浓度的差异而变化。从图2、图3得出低浓度0.2%的盐对酸枣的生长无抑制影响，且在酸枣幼苗的叶片增长和株高增长方面变化高于CK，说明酸枣生长需要一定浓度的Na+、CI-。这与陈阳春等的研究一致[11-12]。胁迫26 d,0.8%盐浓度株高变化值与CK 相比有显著差异，0.8%盐浓度叶片变化值是CK 的49.39%。本研究证明，随着盐浓度升高，酸枣生长受到抑制，生物量大幅下降，这与刘国花的研究结论[13]一致，这是由于在盐胁迫下，一些低浓度的营养元素供应不足[14]。植株碳同化量减少、渗透调节能耗和维持生长能耗增加等原因，一般会使植株生长量和积累量减少[15]。在种子萌发试验中，各胁迫浓度均抑制酸枣种子萌发，牛灵慧等[15]认为渗透效应是指当基质中盐分含量增加时，渗透压也随之提高，水势相应降低，导致种子吸水困难，从而影响种子萌发。

本研究发现不同盐浓度胁迫条件下叶片变化各浓度间在胁迫期间均无显著性差异。但由图3可知，0.2%盐浓度叶片变化值与0.8%浓度叶片变化值在胁迫16 d后出现明显差异。同时，同处理各单株间同项指标差异较大。可能原因是酸枣为异花授粉植物，各种子因基因型不同，其抗逆性表现有显著差异，在盐胁迫条件下各单株表现具有显著差异。因此，本研究通过筛选耐盐单株及盐敏感单株，预利用离体培养方法得到同基因酸枣耐盐株系和盐敏感株系，以减少因基因型差异而引起的试验误差，得到更准确的研究成果。

3.2 结论

不同盐浓度胁迫对离体培养酸枣种子的萌发有显著影响，接种2～4 d开始萌发，8 d后各处理发芽结束，但处理间开始萌发和结束萌发时间不同，CK、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%浓度处理下的最终萌发率分别为90.63%、71.43%、25.00%、21.21%、13.51%。离体培养酸枣种子萌发的耐盐阈值为0.4%,而离体培养酸枣幼苗的耐盐阈值为0.6%。结论与王志强[9]山西酸枣的耐盐碱极限浓度是 0.6%结论一致。本研究共筛选出19株耐盐单株和6株盐敏感单株。