富硒黄芪提取物对免疫抑制大鼠细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ及 TN F-α 的影响 *

李 钦 ，范 强 ，胡继宏 ，高 博 ，宋 爽 ，李海东 ，杨丽霞

1甘肃卫生职业学院，甘肃 兰州 730000；2甘肃中医药大学；3甘肃省渭源县康荣中药材科技有限公司；4甘肃省中医药研究院

黄芪始载于《神农本草经》，为豆科黄芪属植物膜荚黄芪及内蒙古黄芪的根[1]。黄芪属植物是一种多年生、深根性的草本药用植物，别名绵芪、绵黄芪。在我国主要分布于北方地区，普遍生长在东北的东部山区及大兴安岭，部分平原地区亦可见到，此外河北、山西、山东、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、青海、新疆等省区均有分布。黄芪性温味甘，归肺、脾经，具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌的功效。黄芪的主要化学成分有多糖类、皂苷类和黄酮类等[2]，具有增强免疫功能、抗应激、抗衰老、保肝、利尿、降压以及较广泛的抗菌作用[3-8]。但是药用黄芪由于产地、采收季节和生长年限的不同而存在差异，这些差异使得不同来源的同种黄芪的化学组成含量也可能不同，必然影响临床疗效和中药的实验研究。富硒黄芪为甘肃省道地药材，本研究主要观察富硒黄芪提取物对免疫抑制大鼠模型免疫细胞因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 110只SPF级SD大鼠，体质量(180±20)g，雌雄各半，由甘肃中医药大学科研试验中心提供。实验动物质量合格证号：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 实验药品与试剂 富硒黄芪、普通黄芪购自甘肃省渭源县康荣中药材专业合作社。提取物的制备：将2种黄芪药材粉碎过10目筛，加水浸泡30分钟，经超声提取2次，45 min/次，合并滤液，浓缩，滤过，加适量蒸馏水，将溶液pH调至近中性，G4垂熔玻璃漏斗滤过，使其成为1g/mL水溶液，灭菌，冷藏备用。使用前用蒸馏水稀释成1mL/0.1kg(体质量)。注射用环磷酰胺[安道生，Baxter Oncology(德国)提供]。酶联免疫试剂盒：白细胞介素 2(IL-2)、白细胞介素 4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 实验仪器 LX-820型医用低速离心机(金坛市恒丰仪器厂)；FA2004N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；KQ-5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 免疫抑制大鼠模型的建立 110只大鼠，腹腔注射环磷酰胺，每次80 mg/kg(体质量)，1次/d，连用3天，构建免疫抑制模型大鼠；另取10只大鼠为空白对照组，腹腔注射等体积蒸馏水。第3次注射24小时后(如造模成功，记作停药0天)，分别从模型组和空白对照组中各取2只大鼠，采用股动脉采血方法取3 mL血液，用于测定血液WBC(如造模成功，本次检测结果记做药物实验0天)，WBC显著降低则判定为造模成功，若未显著降低则继续注射环磷酰胺，直至造模成功。

1.4.2 动物分组与给药 从造模成功后的模型大鼠中选取50只体况接近的免疫抑制模型大鼠，雌雄各半，按性别、体质量随机分为模型组、富硒黄芪提取物高、中、低剂量组(200、100、50 mg/kg)、普通黄芪提取物组(200 mg/kg)，每组10只；另设10只健康大鼠为空白组。各组大鼠按100mg/(kg·d)剂量灌服相应药物，模型组及空白组大鼠灌服等体积蒸馏水，1次/d，连续7天。

1.4.3 取材 给药第7天后，各组大鼠禁食8小时，颈椎脱位法处死后股动脉取血，分离血清，-20℃保存，备检。

1.4.4 指标检测 1)处死大鼠后取出胸腺、脾脏，记录质量变化，按“胸腺(mg)/体质量(g)、脾脏(mg)/体质量(g)”计算胸腺指数和脾脏指数。2)用酶联免疫法(ELISA)检测大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ 等免疫细胞因子含量。

1.5 统计学方法 数据采用SPSS 19.0统计软件分析，计量资料以(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 富硒黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺、脾脏指数的影响 与空白组比较，模型组大鼠胸腺指数及脾脏指数显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，各药物干预组大鼠胸腺指数及脾脏指数有所升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺指数、脾脏指数的影响(±s) mg/g

表1 黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺指数、脾脏指数的影响(±s) mg/g

注：#表示与空白组比较，P＜0.05；＊表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 胸腺指数 脾脏指数空白组 1 0 0.7 0±0.1 5 3.0 1±0.4 5模型组 1 0 0.2 3±0.1 1#0.9 6±0.1 4#富硒黄芪提取物高剂量 1 0 0.5 0±0.0 9＊2.4 2±0.4 7＊富硒黄芪提取物中剂量 1 0 0.4 3±0.0 6＊1.9 5±0.5 4＊富硒黄芪提取物低剂量 1 0 0.4 0±0.0 5＊1.6 0±0.2 6＊普通黄芪提取物组 1 0 0.3 6±0.0 9＊1.4 9±0.4 5＊

2.2 富硒黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ及TNF-α表达水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠IL-2、IL-4、IFN-γ含量降低，TNF-α含量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，各药物干预组大鼠IL-2、IL-4、IFN-γ含量升高，TNF-α含量降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 富硒黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4含量的影响(±s) pg/mL

表2 富硒黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4含量的影响(±s) pg/mL

注：#表示与空白组比较，P＜0.05；＊表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 T N F-α I F N-γ I L-2 I L-4空白组 1 0 3 9.5 2±5.2 8 2 4.3 1±5.8 6 2 6 1.5 1±4 6.2 0 1 8.9 1±2.5 6模型组 1 0 7 0.1 4±6.6 8# 1 0.8 8±3.1 7# 1 5 3.7 4±3 4.9 6# 9.3 2±3.8 6#富硒黄芪提取物高剂量组 1 0 4 1.2 8±7.2 2＊ 2 0.9 0±5.1 8＊ 2 4 8.2 7±4 4.3 2＊ 1 8.1 6±1.7 4＊富硒黄芪提取物中剂量组 1 0 4 3.0 3±5.6 9＊ 1 9.1 0±4.8 1＊ 2 3 7.6 5±2 6.0 8＊ 1 7.6 5±2.2 6＊富硒黄芪提取物低剂量组 1 0 4 4.9 1±1 6.3 9＊ 1 7.6 5±4.2 3＊ 2 3 1.7 2±2 7.1 2＊ 1 6.8 7±1.8 3＊普通黄芪提取物组 1 0 5 2.0 4±7.4 2＊ 1 5.5 0±2.8 3＊ 1 9 0.9 0±1 9.3 6＊ 1 5.5 9±0.9 0＊

3 讨论

免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体健康。因此，免疫相关研究一直是医学界的热点课题，研究较多的是免疫抑制方面，主要针对开发免疫抑制药物。在免疫抑制研究方面，动物模型的建立直接影响研究的结果，免疫抑制动物模型的建立，一般选用的药物有环磷酰胺、长效糖皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、长春新碱、放线菌素等[9]，其中应用最广泛，研究最多的一种建模药物是环磷酰胺。环磷酰胺是一种细胞毒性药物，属于烷化剂类免疫抑制剂，其能杀死有丝分裂和进入循环周期的细胞，破坏DNA结构，阻断复制，有较强的免疫抑制作用。当免疫细胞受到抗原刺激后，它们在脾脏进行增殖分化，而胸腺是T细胞成熟的重要场所，因此，脾脏和胸腺的相对质量和免疫功能有关[10]。细胞因子在免疫系统中发挥重要作用，同时也是免疫调节的潜在靶点。脾脏是最大的外周免疫器官，受抗原刺激后，参与机体细胞和体液免疫的T细胞、B细胞和巨噬细胞大量增生，致脾滤泡增大，脾体积增大；而受到免疫抑制影响时淋巴组织萎缩，致脾体积缩小。因此，免疫器官指数说明了免疫器官的发育状况，间接体现机体的免疫状态。IL-2、IL-4是T细胞分泌的重要细胞因子，具有较强的免疫刺激作用，参与免疫应答和免疫调节，是衡量机体免疫功能，尤其是细胞免疫水平的重要标志。适量的TNF-α参与机体的正常免疫调节，是机体免疫防护的重要介质，分泌过多则参与机体的免疫病理损伤，导致某些疾病[11]。

近年，中医药在免疫方面的研究开展较多。黄芪是我国经典传统补益中药，为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。味甘性温，具有健脾补中、升阳举陷、益卫固表、利尿、托毒生肌之功效。其主要有效成分为皂苷、多糖、黄酮等。杨小敏等[12]研究发现黄芪皂苷能增强小鼠腹腔巨噬细胞的免疫功能。黄芪多糖对于心脑血管疾病、内分泌疾病、泌尿系统疾病、免疫系统疾病等多种临床疾病有积极的疗效[13]。黄芪总黄酮具有抗损伤、抗突变、抗肿瘤和抑制动脉粥样硬化等多种生物学效应[14]。鉴于药用黄芪由于产地、采收季节和生长年限的不同而存在的差异，深入研究富硒黄芪的生物活性，加强深层次的研究具有重要的现实意义。刘必旺等[15]将黄芪药渣发酵，得到产物富硒酵母，对免疫低下糖尿病模型动物进行不同药物干预，结果发现富硒酵母可降低纤维蛋白原(FBG)和提高胰岛素(INS)水平，同时可提高WBC，IgG及IL-2等免疫指标，黄芪药渣发酵产物-富硒酵母具有降糖及提高免疫功能的作用。黄芪本身富含硒，具有降低心肌细胞对病毒易感性、调节细胞因子、刺激免疫球蛋白形成、激活T细胞、促进淋巴细胞分泌淋巴因子、增强淋巴细胞的细胞毒作用、提高机体免疫等重要功能[16]。另有研究[17]证实黄芪对小鼠脑和肝组织的脂质过氧化反应有明显抑制作用，可增强血清、肝组织的硒含量，加强内源性氧自由基清除系统的功能，减少由自由基作用生成的脂质过氧化物。但目前国内外尚缺乏对培育的富硒黄芪的有关实验及临床研究。

本研究选用甘肃省渭源县康荣中药材专业合作社培育的新品种富硒黄芪为研究对象，通过观察其对免疫抑制模型大鼠的影响，初步探讨富硒黄芪对免疫功能的作用，为黄芪新品种的应用和开发提供科学依据。通过研究发现：环磷酰胺可引起大鼠免疫器官质量以及免疫细胞因子TNF-α含量升高，说明大鼠的免疫功能受到抑制。与模型组比较，各药物干预组胸腺指数及脾脏指数有所升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示大鼠的免疫功能有所恢复，表明富硒黄芪提取物能显著提高环磷酰胺所致免疫抑制模型大鼠的免疫功能，且这种作用较普通黄芪更为显著。

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