衍生化LC-MS／MS法测定大鼠血浆中内源性谷胱甘肽的含量

徐鹏遥，杨 漾，苏梦翔*，狄 斌**

（中国药科大学 1江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室；2蛋白质化学与结构生物学重点实验室；3药物分析系，南京210009）

谷胱甘肽（glutatione）［1］是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合且含有巯基的三肽，具有抗氧化及整合解毒的作用。谷胱甘肽不仅作为内源性物质参与生命活动，在临床上也有着广泛应用。主要用于治疗重金属、氟化物等中毒以及辅助治疗肝炎、溶血性疾病、白内障等疾病，其含量水平与机体健康息息相关［2］。

谷胱甘肽体内分析最大的难点在于它的不稳定性，其在血浆中能迅速转化为氧化型谷胱甘肽，增加了样品的测定难度。血浆中谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽的比值是反映机体氧化损伤的重要指标，从20世纪50年代起，研究者就开始建立谷胱甘肽的各种测定方法。目前主要包括荧光光谱法、HPLC法、HPCE法及质谱法等［3－7］，其中LC-MS／MS法是现今最常用的测定谷胱甘肽的方法。在已有的文献报道中［8－10］，对谷胱甘肽进行直接测定的定量限多在50～200 nmol／L之间，灵敏度和选择性都不能满足生物体内样本分析的要求。对谷胱甘肽进行衍生化能够有效保护半胱氨酸中的残基，避免谷胱甘肽被氧化，使得测定值更加接近实际值。目前利用衍生化法测定谷胱甘肽的定量限多集中在1～100 nmol／L之间［11－13］。但现有的衍生化法存在灵敏度低、前处理复杂、重复性差等问题。随着对谷胱甘肽研究的不断深入，如何解决干扰、快速并准确的测定复杂样品中谷胱甘肽的含量成了研究热点之一。

本研究将新型季铵衍生化试剂4-（N-马来酰亚胺）苯基三甲基碘化铵（MPTA）应用于谷胱甘肽在大鼠血浆中的测定，并进行方法学验证。极大地提高了对谷胱甘肽测定的灵敏度，最终定量下限可达到10 pmol／L左右。目前尚未有文献对大鼠血浆中内源性谷胱甘肽的测定进行报道。少量文献对测定人体血浆中谷胱甘肽的含量进行了报道［14－16］，由于谷胱甘肽的不稳定性及分析方法的不同，使得这些研究的测定结果存在着很大差异。此外，在内源性谷胱甘肽的测定中，大量含巯基的内源性蛋白会对样品的衍生化产生较大的干扰，也会使测定结果存在差异。因此本方法对生物体内谷胱甘肽准确的定量、定性分析，以及其存在状态的正确评价有着重要的临床意义。

1 材 料

1.1 药品与试剂

乙腈（色谱纯，美国默克公司）；甲酸（色谱纯，美国天地公司）；MPTA（自制，纯度大于98%）；甘氨酰酪氨酸内标（上海阿拉丁生化科技有限公司，纯度大于98%），L-还原型谷胱甘肽（GSH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度大于98%）水淡超纯水。

1.2 仪 器

Shimadzu 2010高效液相色谱仪（日本岛津公司），含在线真空脱气机、四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱；Thermo TSQ质谱仪（美国赛默飞世尔公司），含电喷雾离子源ESI、Xcalibur数据工作站；BS 21 S十万分之一分析天平（德国赛多利斯公司）；XHF-1高速分散器（上海金达生化仪器厂）；PL5242纯化水制备系统（美国颇尔公司）；D3415R低温高速离心机（美国BioTool公司）。

1.3 动 物

雄性SPF级SD大鼠，体重（200±20）g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（沪）2013-0006。

2 方 法

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax HILIC PLUS色谱柱（4.6 mm×100 mm，3.5μm）；预柱：菲罗门 C4（4.0 mm×2.0 mm）；流动相：乙腈-水（含 0.1%甲酸）（75∶25）；流速：1 mL／min；柱温：35℃。内标：甘氨酰酪氨酸。

2.2 质谱条件

离子化方式：ESI；扫描方式：选择反应监测（SRM）；离子极性：正离子；检测：谷胱甘肽原型监测离子为m／z308.06→179.00（M＋H）＋，碰撞电压为25 eV。谷胱甘肽衍生化产物监测离子为m／z538.20→265.02（M＋H）＋，碰撞电压为35 eV。内标监测离子为m／z239.14→91.05［M＋H］＋，碰撞电压为40 eV。

质谱参数为：喷雾电压4 000 eV；毛细管温度350℃；鞘气压力30 psi（1 psi＝6 894.8 Pa）；反吹气压力1 psi；套管透镜补偿电压67 V；源内碰撞解析电压8 V。

2.3 标准溶液及内标溶液的配制

2.3.1 谷胱甘肽储备液的配制 精密称取样品约10 mg，置 100 mL量瓶中，用稀释液（乙腈-水-甲酸，50∶50∶0.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中约含谷胱甘肽0.1 mg的溶液作为母液，－80℃保存备用。

2.3.2 内标标准品储备液的配制 精密称取甘氨酰酪氨酸约10 mg，置10 mL量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每 1 mL中约含1.0 mg的溶液，作为母液，以稀释液稀释制成质量浓度为50μg／mL的内标储备液。－80℃保存备用。

2.3.3 衍生化试剂溶液的配制 精密称取MPTA约10 mg，置10mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中约含1.0 mg的溶液，作为衍生化试剂，最终稀释成0.1 mg／mL，现用现配。

2.3.4 谷胱甘肽-MPTA储备液配制 将上述的谷胱甘肽储备液与0.1 mg／mL的衍生化试剂进行反应，反应结束后加入过量的半胱氨酸与衍生化试剂反应。按照反应充分进行计算得到每1 mL中含谷胱甘肽衍生物0.1 mg的溶液作为母液。－80℃保存备用。

2.4 前处理方法

2.4.1 方法学样品前处理 精密吸取血浆样品50μL，置1.5 mL塑料尖头离心管中，精密加入谷胱甘肽-MPTA溶液及内标溶液各5μL，加入乙腈100μL，旋涡 1 min后，4℃，12 000 r／min离心10 min，取上清液直接进样，取上清液10μL进样分析，按内标法计算血浆样品中谷胱甘肽的浓度。2.4.2 血浆样品前处理 精密吸取血浆样品50μL，置1.5 mL塑料尖头离心管中，精密加入内标溶液 5μL，加入衍生化试剂（0.1 mg／mL）100μL，20℃旋涡40min后4℃，12 000 r／min离心10 min，取上清液直接进样，取上清液10μL进样分析，按内标法计算血浆样品中谷胱甘肽的浓度。

3 结 果

3.1 方法专属性

在本实验所采用的色谱条件下，谷胱甘肽衍生物的出峰时间在2.85 min，内标出峰时间在1.58 min，峰形良好，基线平稳。本实验考察了大鼠空白血浆及方法学低浓度点样品色谱图，结果表明方法特异性好，样品和内标测定不受干扰，专属性结果见图1。

Figure 1 Representative SRM chromatogramsof a blank plasma sample（A）；a blank plasma sample（B）；a blank plasma sample spiked with the internal standard（IS）（C）；and a blank plasma sample spiked with glutathione（GSH）at the limit of quantitation（3.000 ng／mL）（D）

3.2 线性范围

精密吸取相关储备液，配成模拟血浆质量浓度为 3.000，10.00，30.00，100.0，300.0，1 000，2 000 ng／mL的血浆样品。按照“2.4”项下方法学样品处理方法同法处理，取10μL进样分析，分别记录谷胱甘肽衍生物的色谱峰面积（As）及内标的色谱峰面积（Ai）。以谷胱甘肽衍生化产物峰面积与内标峰面积的比值（As／Ai）为横坐标，以GSH的质量浓度c（ng／mL）为纵坐标，进行线性权重回归（权重系数为1／c2）：3.000～2 000 ng／mL。在不同天处理5条标准曲线，分别为：y＝0.004 8x＋0.136 4；y＝0.008 0x－0.590 2；y＝0.004 4x＋0.266 7；y＝0.002 7x＋0.248 7；y＝0.005 5x－0.082 3。

血浆5条标准曲线平均比值回归方程为c＝183×－0.323 4，相关系数r为 0.997 1。按上述方法血浆中谷胱甘肽的线性范围为3.000～2 000 ng／mL，定量下限（LLOQ）定为标准曲线的最低浓度点，即3.000 ng／mL。

3.3 准确度

精密吸取血浆样品50μL，置1.5 mL塑料尖头离心管中，精密加入谷胱甘肽-MPTA溶液5μL，涡旋 30 s，制成含 10.00，100.0，1 000 ng／mL，谷胱甘肽-MPTA低、中、高3个质量浓度的样品。精密加入内标溶液5μL，加入乙腈100μL，旋涡1 min后4℃，12 000 r／min离心10 min，取上清液直接进样，取上清液10μL进样分析，按内标法计算血浆样品中谷胱甘肽的浓度。连续测定5次，考察方法准确性。结果表明方法准确度良好，低、中、高3个质量浓度的准确度在85%～115%之间，RSD在4.56%～13.91%之间。

3.4 提取回收率

样品的制备：取空白血浆50μL置1.5 mL样品管中，精密加入谷胱甘肽-MPTA标准品溶液，涡旋30 s混匀，分别制成含10.00，100.0和1 000 ng／mL，谷胱甘肽-MPTA的低、中、高3个浓度的样品，每种浓度各5份，按照“2.4”项下方法学样品处理方法同法处理，取10μL进样分析。

对照品的制备：取空白血浆50μL，置1.5 mL塑料尖头离心管中，加入100μL的乙腈，涡旋30 s，12 000 r／min，离心 5 min。于上清液中加入内标5μL以及谷胱甘肽-MPTA标准溶液5μL，配制成浓度点为 10.00，100.0，1 000 ng／mL的样品，涡旋1 min，12 000 r／min离心 5 min，取上清液作为对照低、中、高3个浓度各5份。

分别取上述溶液各10μL进样。按As／Asr×100%计算样品提取回收率，其中As为样品溶液中谷胱甘肽衍生物的峰面积，Asr为对照溶液中谷胱甘肽衍生物的峰面积。按Ai／Air×100%计算内标提取回收率，其中Ai为样品溶液中内标的峰面积，Air分对照溶液中内标的峰面积。结果表明低、中、高3种质量浓度的提取回收率均大于50%且稳定。

3.5 基质效应

3.5.1 基质样品的制备 取空白血浆50μL，置1.5 mL塑料尖头离心管中，加入乙腈100μL，涡旋30 s，12 000 r／min，离心5 min。于上清液中加入内标5μL以及GSH-MPTA标准溶液5μL，配制成质量浓度为 10.00，100.0，1 000 ng／mL的样品，涡旋1 min，12 000 r／min离心 5 min，取上清液进样，低、中、高3个质量浓度各5份。

3.5.2 对照样品的制备 于1.5 mL离心管中分别精密加入含GSH-MPTA 100.0，1 000和10 000 ng／mL的标准品储备液各5μL，加入PBS缓冲液50μL，涡旋30 s，制得低、中、高3个质量浓度的对照样品，每个质量浓度各做5份，计算基质效应。低、中、高质量浓度测得基质效应的比值分别为114.79%、107.54%和 105.93%，RSD分别为11.54%、7.89%和5.85%。上述结果表明谷胱甘肽在本实验条件下不受基质效应的影响，符合生物样本测定的要求。

3.6 稳定性考察

制备中浓度（100.0 ng／mL）的样品 1份，按“2.4”项下血浆样品前处理方法同法处理，立即取上清液10μL进样，作为0 h的样品溶液；将剩余的样品溶液于4℃进样器样品盘中放置24 h后，取10μL进样。由标准曲线求出各样品的浓度，与0 h的相应浓度比较。由测定结果可知处理后的谷胱甘肽-MPTA进样溶液放置于4℃的样品盘上，12 h内稳定性良好，但24 h后样品降解较为严重。

3.7 方法应用

将上述建立的方法对实际大鼠空白血浆中内源性谷胱甘肽进行检测。选取6批大鼠空白血浆，按“2.4”项下血浆样品前处理方法同法处理后，取10μL进样测定，结果见表1。

Table 1 Determination of endogenous glutathione（GSH）in rat′s plasma

4 讨 论

4.1 衍生化试剂的选择

在内源性谷胱甘肽的测定中，血浆中大量的含巯基内源性蛋白会对样品的衍生化产生较大的干扰。为避免这一干扰，本研究选用MPTA作为衍生化试剂。内源性蛋白相对分子质量大，立体位阻大，难以在同样条件下与MPTA反应。谷胱甘肽的离子化效率较低以及基质抑制都使得样品的质谱响应较低，MPTA在谷胱甘肽衍生化产物中同时引入了季铵基团和烷基链。季铵基团自身带一个正电荷，在质谱中响应很高；烷基链能够增加疏水性，以此增加衍生化产物的离子化效率。因此极大提高了本方法对谷胱甘肽测定的灵敏度，最终定量下限可达到10 pmol／L左右。此外，衍生化试剂MPTA所含的马来酰亚胺基团与谷胱甘肽中的巯基发生迈克尔加成反应，该反应十分迅速，条件温和，并且能够避免半胱氨酸中的残基与血浆中内源性物质生产二硫键，从而提高了样品稳定性，成功解决了目前衍生化法存在的操作繁琐、耗时较长、重复性差等问题。衍生化试剂结构及反应如图2所示。

Figure 2 Derivatization of GSH with 4-（N-maleimido）phenyl trimethylammonium iodide（MPTA）

4.2 谷胱甘肽衍生化条件优化

本实验中，对衍生化条件进行优化，考察温度、反应时间及衍生化试剂的浓度对反应的影响。每个条件下平行配制6份样品，根据峰面积及峰面积的RSD选择最优的反应条件。谷胱甘肽选择质量浓度为300.0 ng／mL。由表2可知，衍生化试剂浓度越大对谷胱甘肽的影响较大，随着质量浓度增加，其峰面积反而越来越小，推测由于衍生化试剂与多肽样品之间存在离子抑制。在反应时间为40 min，衍生化温度为30℃的实验条件下，根据峰面积大小及RSD的比较，选择0.1 mg／mL的衍生化试剂浓度。反应时间对峰面积的影响不是太大，但是对峰面积的稳定性影响比较大，在反应温度40℃，衍生化试剂质量浓度为0.1 mg／mL，结合峰面积大小及峰面积的RSD选择反应时间为40 min。反应温度结果显示，在40 min、衍生化试剂质量浓度为0.1 mg／mL反应温度为20℃的反应条件下，其峰面积最稳定。因此，最终确定的反应条件为反应温度20℃，反应时间40 min，衍生化试剂的质量浓度为0.1 mg／mL。

Table 2 Effect of various factors on GSH derivatization

Effect factors Level Peak areas RSD／%c（MPTA）0.1 mg／mL 115 022 10.75 0.5 mg／mL 178 397 12.61 1.0 mg／mL 118 265 11.44 1.5 mg／mL 153 133 11.05 t R 10 min 124 891 34.74 20 min 105 890 27.97 30 min 119 437 41.53 40 min 131 658 11.47 Reaction temperature 10℃ 202 540 40.90 20℃ 238 615 13.76 30℃ 193 329 28.88 40℃ 6 512 48.29

4.3 色谱条件的选择

由于巯基的存在，使得谷胱甘肽具有很强的极性和水溶性。在以往液相色谱检测谷胱甘肽过程中，较常采用的是反相C18色谱柱，但这种色谱柱对强极性的化合物保留很弱。因此，本实验选用保留有机不同的亲水作用色谱（HILIC）体系。该体系采用高比例的有机相及少量的水相组成二元流动相，在极性的固定相上进行洗脱分析，高挥发有机相具有较低的离子抑制尤其适宜与电喷雾（ESI）联用，提高了质谱检测的灵敏度［17］。同时，高比例有机相具有低黏度和高渗透性的特点，与相似柱粒径和流速的RPLC相比，色谱柱压大大降低，因此可以获得较高的色谱柱效和对称的峰型，从而实现快速分析。流动相为乙腈-水（含0.1%甲酸）（75∶25）时，谷胱甘肽在Zorbax HILIC PLUS色谱柱上保留时间合适，色谱峰形良好并且能与内标物有效分离。

4.4 质谱条件优化

谷胱甘肽与MPTA衍生化后，产物相对分子质量为537，其在正离子模式下容易产生（M＋H）＋峰，根据流动注射实验结果确定其正负离子模式及单／多电荷峰。谷胱甘肽产物的相对分子质量为537，其母离子为MSm／z538.20，兼顾离子响应灵敏度高与稳定性好两个方面选择监测子离子为MSm／z265.02，碰撞电压为35 eV。选择甘氨酰酪氨酸作为内标，其母离子同样为单电荷，兼顾离子响应灵敏度与稳定性，选择内标的监测离子对为MSm／z239.14→91.05，碰撞电压为40 eV。谷胱甘肽原型相对分子质量为307，其母离子为 MSm／z308.06，兼顾离子响应灵敏度高与稳定性好两个方面选择监测子离子为MSm／z179.00，碰撞电压为25 eV。质谱参数为：喷雾电压4 000 eV；毛细管温度350℃；鞘气压力30 psi；反吹气压力1 psi；套管透镜补偿电压67 V；源内碰撞解析电压8 V。

5 小 结

本研究建立了衍生化LC-MS／MS测定血浆中的内源性谷胱甘肽的方法，在3.000～2 000 ng／mL范围内线性良好，相关系数r大于0.99；定量下限的精密度和准确度均符合要求；低浓度样品的准确度在80%～120%之间，中，高浓度的准确度在85%～115%之间；处理后的进样溶液放置于4℃的样品盘上，在12 h内的稳定。最终测得大鼠血浆中内源性谷胱甘肽质量浓度在10 ng／mL左右。考虑到谷胱甘肽为血浆中内源性物质，实验过程中先对谷胱甘肽对照溶液进行衍生化处理，并将多余的MPTA与半胱氨酸反应，之后加入空白基质中进行方法学验证，其中内源性的半胱氨酸并不会干扰测定。本研究建立的衍生化方法可以快速准确地对血浆中谷胱甘肽进行测定，并且能够增加多肽的质谱响应，提高方法灵敏度。同时，具有前处理操作简单、使用试剂种类较少、反应效率高等优点。

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