趋化因子受体7在人结肠癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

蔡逊 王世杰 马丹丹 张智勇

结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，目前其在我国的发病率呈逐年上升趋势[1-2]。肿瘤的侵袭和转移是导致结肠癌死亡的主要原因[3-5]，其中肝脏转移是最常见的远处转移[6]。因此，如能阻断结肠癌转移途径，则能大大提高结肠癌病人的生存率。近年来，趋化因子及其受体在肿瘤发生发展、侵袭转移中的作用受到广泛关注[7-8]。研究表明：趋化因子受体7(chemokine receptor 7，CCR7)是7次跨膜受体G蛋白偶联受体，在肿瘤细胞的增殖、迁移、播散及肿瘤血管形成中发挥关键作用[9-10]。本研究旨在采用免疫组织化学、Real-time PCR及Western blot等技术检测CCR7在90例结肠癌组织中的表达情况，探讨其表达水平与与结肠癌淋巴结转移、远处转移等临床病理特征的相关性。以期为寻找结肠癌新的治疗靶点提供有力依据。

资料与方法

一、资料及试剂

1.一般资料 选取我院2015年1月至12月的90例人结肠癌组织及其配对癌旁组织标本，所有标本均经病理证实，且术前未行化疗或放疗。癌旁组织标本取自至少距肿瘤边缘5cm处，新鲜标本离体后立即置入液氮中保存。所有标本的获取均征得病人本人及家属同意，并通过本院伦理委员会批准。

2.主要试剂 兔抗人CCR7单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗均购自Abcam公司。Trizol试剂盒、逆转录试剂盒购自Invitrogen公司，总蛋白抽提试剂盒、RNA提取试剂盒购自Tiangen公司。免疫组织化学试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色液购自武汉博士德生物公司。CCR7引物序列为：上游引物是5′-AGGCTATTGTCCCCTAAACC-3′及下游引物是5′-GGAGGACAGTGAAGAAAACG-3′；β-actin引物序列为：上游引物是5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′及下游引物是5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。均由上海英骏生物工程技术服务公司设计并合成。

二、实验方法

1.免疫组织化学染色及结果判定 免疫组织化学染色按试剂盒实验步骤操作，常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，微波抗原修复，兔抗人CCR7单克隆抗体(1∶200稀释)，4 ℃过夜孵育，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片固定。用磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作阴性对照，相同条件下每个样本重复3次。结果判定标准：CCR7表达免疫组织化学结果根据阳性细胞率进行评定和分析。未见阳性细胞或阳性细胞率<5%判定为阴性(-)，阳性细胞率5%～25%定为弱阳性(+)，25%～50%为中度阳性(++)，>50%为强阳性(+++)。

2. Real-time PCR检测CCR7 mRNA表达 采用Trizol试剂盒提取90例结肠癌组织及配对癌旁组织的总mRNA，以紫外分光光度仪检测其吸光度值(A260 nm/A280 nm值为1.8～2.0为理想值)，计算其浓度以便指导逆转录模板的需要量。接着用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，保存于-80℃冰箱备用。所有操作步骤均按照说明书进行。Real-time PCR总反应体系为20 μl：2×SYBR Green mix缓冲液10 μl，10 μmol/L的上下游引物各0.6 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6.8 μl。反应参数为：94℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s；共35个循环；72 ℃终延伸5 min。每个样本均做3个复孔，并重复3次。各组中CCR7的相对表达量通过2-ΔΔCt法进行计算。

3.Western blot检测CCR7蛋白表达 分别称取0.1 g结肠癌组织和癌旁组织，加800 μl全蛋白提取液(放射免疫沉淀裂解液，RIPA)，含10%蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)提取蛋白。采用Bradford法进行蛋白定量。各组150 μg上样于5.0%浓缩胶，15%分离胶，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离。电泳结束后转移蛋白于PVDF膜，加5%脱脂奶粉稀释的一抗CCR7及β-actin(1∶500稀释)封闭，4 ℃过夜，加HRP标记二抗(1∶5000稀释)，37 ℃条件温育2 h，化学发光法显影检测。免疫印迹条带的灰度值经灰度扫描仪分析后获得。CCR7相对表达水平通过与内参比较确定。

三、统计学方法

结 果

一、免疫组织化学染色结果

在90例结肠癌组织及癌旁组织中CCR7主要表达于细胞质，呈棕黄色，详见图1。在癌旁组织中，细胞质着色多为淡黄色，CCR7为阴性，弱阳性或中度阳性，然而，在结肠癌组织中，细胞质染色较深，以棕黄色和棕黑色为主，CCR7弱阳性、中度阳性或强阳性。中度阳性及强阳性均判定为阳性表达。组织学评分后的统计结果显示，CCR7蛋白在癌旁组织与结肠癌组织中的阳性表达率分别为36%(32/90)和77%(69/90)。经χ2检验，两者差异有统计学意义(χ2=25.689，P=0.000)。15例发生远处转移的结肠癌组织中，CCR7着色深，有棕黄色颗粒，染色强度均为强阳性。45例发生淋巴结转移的结肠癌组织中62%(28/45)染色强度为强阳性，38%(17/45)染色强度为中度阳性。

A.无淋巴结转移组;B.淋巴结转移组;C.远处转移组图1 CCR7蛋白在结肠癌组织中的表达(免疫组织化学染色,×200)

二、CCR7在结肠癌中的基因表达

在90例结肠癌组织及其相应的癌旁组织中均可检测到CCR7基因的表达，且CCR7 mRNA在结肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(1.59±0.27比0.57±0.08，t=34.828，P=0.000)，见图2。

*P<0.05图2 CCR7基因在结肠癌组织及相应癌旁组织中的表达

三、CCR7在结肠癌中的蛋白表达

Western blot检测结果显示，CCR7蛋白在结肠癌组织及相应癌旁组织中均有表达，在结肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)，且CCR7蛋白在淋巴结转移的结肠癌组织中的表达水平显著高于无淋巴结转移组，存在远处转移结肠癌组织中的表达水平显著高于淋巴结转移组。见图3。

四、CCR7蛋白表达水平与结肠癌临床病理特征之间的关系

CCR7蛋白在结肠癌组织中的表达量以结肠癌组织CCR7条带的灰度值与对应的β-actin的灰度值之比来表示。通过统计分析显示：CCR7蛋白表达量与结肠癌浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关(P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤大小及分化程度无明显相关(P>0.05)。详见表1。

N:癌旁组织;T:结肠癌组织①无淋巴结转移;②淋巴结转移;③远处转移图3 CCR7蛋白在结肠癌组织及相应癌旁组织中的表达

表1 CCR7蛋白表达量与90例结肠癌临床病理特征之间的关系±s)

讨 论

趋化因子是指能使细胞发生趋化运动的分泌型小分子蛋白质(相对分子质量为8000～11000)，趋化因子受体是能够特异性结合趋化因子的7次跨膜G蛋白偶联受体[11-12]。CCR7为CC类趋化因子受体之一，越来越多的证据[13-17 ]显示，CCR7在黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌和胃癌等肿瘤细胞中过度表达，与肿瘤的淋巴结转移和侵袭转移密切相关。然而，对于CCR7在结肠癌生长、浸润、侵袭和转移中的作用研究甚少。

在肿瘤组织及其相应邻近正常组织的差异性表达是分析基因与肿瘤关系的基础，异常表达的基因可能在肿瘤的形成中扮演重要角色，可认为是潜在的新一类控制细胞增殖和凋亡的癌基因和抑癌基因[18]。本研究中，笔者选取90例结肠癌病人的肿瘤组织及相应配对的癌旁组织，分别采用Real-timePCR和Westernblot技术检测CCR7mRNA和蛋白表达，检测结果表明CCR7在结肠癌组织中的表达显著高于相应癌旁组织。免疫组织化学检测结果显示CCR7在结肠癌组织中的蛋白表达定位于细胞质，在癌旁组织中，细胞质着色多为淡黄色，CCR7为阴性，弱阳性或中度阳性，然而，在结肠癌组织中，细胞质染色较深，以棕黄色和棕黑色为主，CCR7弱阳性、中度阳性或强阳性。进一步证实CCR7蛋白在结肠癌组织中的表达同样显著高于癌旁组织。有研究[13-17]称CCR7在多种肿瘤中过表达，促进肿瘤细胞增殖、肿瘤血管生成及肿瘤细胞定向迁移。本研究结果证实：CCR7在结肠癌发生发展过程中具有癌基因特性，促进结肠癌的发生发展。与国外文献报道基本一致。

本实验采用Westernblot技术检测CCR7在结肠癌组织中的蛋白表达量并分析其与临床病理特征的关系，通过统计分析得出：CCR7蛋白表达量与结肠癌浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关，然而与性别、年龄、肿瘤大小及分化程度无明显相关性。Correale等[19]研究得出，CCR7在结肠癌中的表达与病人性别、年龄、肿瘤分型、分期无关，但在直肠癌中的表达与肿瘤分化、分期、淋巴结转移及远处转移密切相关。本研究结果与其基本一致。本实验采用免疫组织化学对90例结肠癌组织及配对的癌旁组织标本进行染色，实验结果表明CCR7主要表达于结肠癌细胞的细胞膜或(和)细胞质内。组织学评分后的统计结果显示，CCR7蛋白在癌旁组织与结肠癌组织中的阳性表达率分别为36%(32/90)和77%(69/90)，差异具有统计学意义。这与Malietzis等[20]的报道相符。本研究中，15例发生远处转移的结肠癌组织中，CCR7着色深，有棕黄色颗粒，染色强度均为强阳性。45例发生淋巴结转移的结肠癌组织中62%(28/45)染色强度为强阳性，38%(17/45)染色强度为中度阳性。有研究[21]表明,约80%的结肠癌组织表达CCR7,且多因素回归分析得出，CCR7高表达是与淋巴结转移相关的最重要因素。本研究结果与这一结论相符。检测结肠癌组织CCR7表达对预测淋巴结转移具有较高的判断价值。另外，术前对镜检标本或前哨淋巴结标本进行CCR7检测，不仅可预测有无淋巴结转移，而且对手术方案的选择及术后进一步的靶向治疗均具有重要价值。

综上所述，CCR7在结肠癌组织中存在过度表达，参与结肠癌发生发展过程，促进其侵袭转移，这可能是结肠癌发生局部浸润和远处转移的关键机制之一。阻断CCR7的表达可能为结肠癌的治疗提供新思路。

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