桑白皮多酚的抗氧化和对UV辐射致成纤维细胞光老化的修复作用

吴永祥

吴丽萍1

王卫东2

金泰完3

(1.黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041；2.黄山峰源生物科技有限公司，安徽 黄山 245600；3.安东国立大学食品科学与生物技术学院，韩国 安东 760749)

皮肤光老化(Photoaging)是指由于皮肤长期暴露在外界有害因素(日晒、烟尘、化学物质等)之下使得皮肤过早地出现衰老现象的一类疾病，其中紫外线是最为主要的诱因[1]。UV辐射会引起成纤维细胞生物学特征的改变，表现为皮肤粗糙、增厚、过多的色素沉着及出现深皱纹[2-3]。长期过量的UV辐射甚至会引起皮肤癌变，严重损害人体健康[4]。研究[5-6]表明，许多植物提取精华和中草药中的化学物质可有效防治皮肤光老化。

桑白皮是桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥根皮，为中国传统常用中药材，主产于安徽、四川、贵州、湖南等地。桑白皮多酚是桑白皮的次生代谢产物，主要包括Diels-Alder型加合物和黄酮类化合物等[7]。桑白皮多酚具有多种生物活性，包括抗氧化[8]、抗病毒[9]、镇痛抗炎[10]、降血糖[11]及改善胰岛素抵抗[12]等。本课题组前期研究[13]发现桑白皮多酚提取物具有抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶及3T3-L1脂肪细胞分化的作用。虽然桑白皮多酚药理作用的研究较多[10-13]，但关于桑白皮多酚对UV辐射致皮肤光老化修复作用的研究仍然缺乏。

本试验拟以桑白皮多酚为原料，首先研究CMP的抗氧化能力，在以成纤维HS68细胞为研究对象，探讨CMP对UV辐射致成纤维细胞光老化的修复作用，并阐明其作用机制，为抗光老化功能性食品的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

桑白皮：安徽亳州药材市场；

成纤维HS68细胞：美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection, ATCC)；

单宁酸(tannic acid, TA)、Folin-Ciocalteu试剂、BHA、ABTS、DPPH、MTT：分析纯，美国Sigma公司；

PIP试剂盒：日本TaKaRa公司；

胎牛血清、DMEM培养液等：美国Gibco公司。

1.1.2 主要仪器设备

全波长酶标仪：SpectraMax-190型，美国Molecular Devices公司；

CO2恒温培养箱：NU-8500型，美国Thermo公司；

超净工作台：DL-CJ-1N型，北京东联哈尔仪器制造有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：LDZF-75KB-III型，上海申安医疗器械厂；

实时荧光定量PCR仪：ECOTM型，美国Illumina公司。

1.2 试验方法

1.2.1 桑白皮多酚提取物的制备 将桑白皮粉碎成粉末，按照料液比1∶10 (g/mL)与70%的乙醇溶液进行混合，室温条件下振荡提取3次，每次4 h，过滤后收集上清液，用旋转蒸发仪浓缩至适量。取提取液加在处理好的大孔吸附树脂柱上，用蒸馏水洗脱，再依次使用不同纯度的乙醇冲洗，收集洗脱液，减压浓缩回收溶剂，冷冻干燥得桑白皮多酚提取物。

1.2.2 多酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu法[14-15]，以单宁酸作为标准品。绘制吸光值Y-质量浓度X的标准曲线Y=0.001X-0.005，R2=0.999。根据标准曲线，计算桑白皮多酚的含量(mg TA/g)。

1.2.3 抗氧化活性的测定

(1) ABTS自由基清除能力：参考文献[16]。

(2) DPPH自由基清除能力：参考文献[17～18]。

1.2.4 成纤维细胞的培养及细胞光老化模型的建立 成纤维HS68细胞置于(+)DMEM培养基(含100 U/mL 青链霉素、10%胎牛血清)，在37 ℃、5% CO2且相对饱和湿度的细胞培养箱中培养。取对数生长期的HS68细胞，以1×105个/mL 接种于24孔板中，每孔500 μL。贴壁培养24 h后，弃培养基，用PBS清洗2次，并铺上500 μL的PBS，置于紫外线灯下辐射。辐射条件：辐射剂量20 mJ/cm2，时间90 s，细胞距离光源20 cm[19]。空白对照组不给予UV辐射。弃PBS，加入DMEM培养基(含100 U/mL 青链霉素、但不含10%胎牛血清)培养。

1.2.5 试验分组 将成纤维HS68细胞设置为空白对照组(无UV辐射及CMP处理)、UV模型组(给予UV辐射，无CMP处理)、CMP试验组(给予UV辐射及CMP处理)，各组均设4个复孔。CMP处理浓度为1，2，5 μg/mL。

1.2.6 细胞增殖活性的测定 接种于24孔板中的HS68细胞，给不同浓度CMP(1，2，5 μg/mL)处理48 h后，每孔加入50 μL的MTT染色液，继续置于细胞培养箱中培养，3 h 后弃上清液，每孔加入500 μL二甲基亚砜溶液，室温避光震荡20 min，于570 nm波长处读取OD值[20]。

1.2.7 PIP含量的测定 将接种于24孔板中的HS68细胞用不同浓度CMP(1，2，5 μg/mL)处理48 h后，收集细胞上清液，采用ELISA法测定细胞培养液中PIP含量，操作方法参考PIP试剂盒说明书。

1.2.8 MMP-1、PIP mRNA表达水平的测定 取HS68细胞以1×105个/mL接种于60 mm的细胞培养皿中，经不同浓度CMP(1，2，5 μg/mL)处理48 h后，用Trizol法提取总RNA，按照PrimeScriptTMRT试剂盒合成cDNAs。加入SYBR Green、引物及cDNA模板，进行实时荧光定量PCR反应。引物设计：MMP-1正义引物为5’-GGT GAT GAA GCA GCC CAG-3’，MMP-1反义引物为5’-CAG TAG AAT GGG AGA GTC-3’；PIP正义引物为5’-GAA CGC GTG TCA TCC CTT GT-3’，PIP反义引物为5’-GAA CGA GGT AGT CTT TCA GCA ACA-3’；β-actin正义引物为5’-GTT GGA CCT GAC AGA CTA CCT CA-3’，β-actin反义引物为5’-GTT GCC AAT AGT GAT GAC CT-3’。

1.3 统计学分析

2 结果与分析

2.1 桑白皮多酚对ABTS自由基的清除作用

由图1可知，CMP具有显著清除ABTS自由基的能力，且清除率随着质量浓度的增大先逐渐增强最后趋于恒定；BHA在1～10 μg/mL时，清除率随着质量浓度的增加而增大，且呈线性相关。CMP和BHA对ABTS自由基清除作用的IC50值分别为1.49，11.25 μg/mL，表明CMP对ABTS自由基清除能力显著强于阳性对照BHA(P<0.05)。故桑白皮多酚具有显著的ABTS自由基清除能力，而多酚类物质是其主要的活性成分。

图1 桑白皮多酚对ABTS自由基的清除作用Figure 1 ABTS free radical scavenging ability of polyphenol from Cortex Mori

2.2 桑白皮多酚对DPPH自由基的清除作用

图2表明，在1～10 μg/mL时，CMP和BHA对DPPH自由基清除能力随着浓度的增加而增强，呈明显的浓度依赖性，且差异显著(P<0.05)。CMP和BHA清除DPPH自由基的IC50值分别为8.94，11.03 μg/mL，说明桑白皮多酚对DPPH自由基清除能力大于人工合成抗氧化剂BHA。以上结果显示，桑白皮多酚对DPPH和ABTS自由基清除能力的变化规律具有较好的一致性，说明多酚类物质是桑白皮的主要抗氧化活性成分。

图2 桑白皮多酚对DPPH自由基的清除作用Figure 2 DPPH free radical scavenging ability of polyphenol from Cortex Mori

2.3 桑白皮多酚对细胞增殖作用的影响

由图3可知，成纤维HS68细胞经UV辐射后，细胞存活率明显降低，与空白对照组比较具有显著性差异(P<0.05)，表明体外HS68细胞光老化模型建立成功。与UV模型组[(60.90±0.46)%]相比，不同浓度CMP(1，2，5 μg/mL)作用48 h后，其细胞存活率分别为(64.78±1.84)%，(70.89±2.20)%，(75.76±0.68)%，呈剂量依赖性增加，且具有统计学意义(P<0.05)。说明桑白皮多酚能提高光老化成纤维细胞的增殖活性，对细胞损伤具有一定的修复作用。后续试验细胞PIP分泌水平及MMP-1、PIP的mRNA表达的测定均采用此浓度的添加量进行研究。

不同小写字母表示差异显著，P<0.05图3 桑白皮多酚对细胞增殖作用的影响Figure 3 Effect of polyphenol from Cortex Mori on cell proliferation

2.4 桑白皮多酚对细胞PIP含量的影响

由图4可知，PIP标准品的质量浓度(Y)与OD值(X)间的标准曲线为Y=47.12X2+106.4X-1.914(R2=0.999)，说明方程拟合有效。由图5可知，成纤维HS68细胞经过UV辐射后，其PIP的含量发生了变化。与空白对照组[(624.09±10.93) ng/mL]相比，UV模型组PIP含量明显降低，达到了(497.58±17.38) ng/mL，存在着显著性差异(P<0.05)。与UV模型组相比，CMP可以显著提高UV辐射后细胞中的PIP含量，随着CMP浓度的增加，PIP含量呈浓度依赖性提高，且有统计学差异(P<0.05)。PIP含量的降低，可导致皮肤中胶原蛋白合成的减少，从而出现皱缩细纹等衰老症状[21]。本试验结果表明，桑白皮多酚增加了UV辐射后成纤维细胞中PIP的含量，具有潜在的抗光老化作用。

图4 PIP标准曲线Figure 4 Standard curve of PIP

不同小写字母表示差异显著，P<0.05图5 桑白皮多酚对细胞PIP含量的影响Figure 5 Effect of polyphenol from Cortex Mori on PIP content

2.5 桑白皮多酚对细胞MMP-1、PIP mRNA表达的影响

由表1可知，与空白对照组相比，UV模型组在给予UV辐射后，细胞中MMP-1的mRNA表达水平显著升高，PIP的mRNA 表达水平显著降低。空白对照组中MMP-1、PIP的mRNA表达水平分别为(0.08±0.00)，(1.00±0.00)，而UV模型组分别为(1.00±0.00)，(0.33±0.01)，两者存在着显著性差异(P<0.05)。与UV模型组相比，CMP能够显著下调UV辐射损伤细胞内MMP-1的mRNA表达量，提高PIP的mRNA水平，且有统计学差异(P<0.05)。研究[22]证明，MMP-1过度表达时，将会抑制PIP的正常表达，破坏皮肤胶原纤维和弹性纤维的正常结构，从而导致皮肤光老化。结果表明，桑白皮多酚通过调控MMP-1和PIP的mRNA表达，起到光老化修复作用。

表1桑白皮多酚对细胞MMP-1、PIP mRNA表达的影响†
Table 1 Effect of polyphenol fromCortexMorion MMP-1, PIP mRNA expressions

组别浓度/(μg·mL-1)MMP⁃1/β⁃actin比值PIP/β⁃actin比值空白对照组-0．08±0．00d1．00±0．00aUV-1．00±0．00a0．33±0．01dCMP11．03±0．04a0．35±0．03cd20．91±0．02b0．39±0．01bc50．84±0．02c0．42±0．02b

† 同列不同上标字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05)。

3 结论

本研究揭示了桑白皮多酚能有效抵抗UV诱导的皮肤光老化，其作用机制可能与有效清除自由基，抑制细胞内MMP-1表达及调控PIP合成有关。下一步将对桑白皮多酚做进一步的分离纯化，以明确桑白皮多酚抗皮肤光老化的主要活性成分。

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