奥洛他定联合卡介菌多糖核酸对慢性荨麻疹患者的免疫应答机制探讨

罗文峰，程喜平，王继辉，许德清

（1.广东省佛山市中医院 皮肤科，广东 佛山 528000；2.广州医科大学第一附属医院皮肤科，广东 广州 510120；3.广东省佛山市第一人民医院皮肤科，广东 佛山 528000；4.广东省中山大学孙逸仙纪念医院 皮肤科，广东 广州 510120）

慢性荨麻疹是以风团和瘙痒为主要临床症状的自身免疫性皮肤疾病，病机及发病机制尚未完全明确。免疫球蛋白E（immunoglobulins-E，IgE）介导的Ⅰ型变态反应以及Th1/Th2免疫应答紊乱被认为与慢性荨麻疹的发病密切相关[1-2]。盐酸非索非那是具有抗组胺活性的新型药物，能够拮抗组胺所介导的炎症反应以及免疫应答紊乱；卡介菌多糖核酸是一类非特异性免疫调节剂，具有抑制肥大细胞脱颗粒、与IgE抗体竞争性结合抗原的作用。已有研究报道，奥洛他定联合卡介菌多糖核酸在慢性荨麻疹的治疗中展现出积极价值，但是关于该治疗方案发挥治疗作用的分子机制并不明确[3]。Toll样受体（toll like receptor，TLR）是体内重要的模式识别受体，参与免疫应答以及炎症反应的调控。TLRs家族中的TLR2被证实与慢性荨麻疹的发生有关[4-5]。在下列研究中，本研究分析奥洛他定联合卡介菌多糖核酸是否通过TLR2通路调节慢性荨麻疹患者的免疫应答。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016年1月-2016年11月在佛山市中医院皮肤科确诊为慢性荨麻疹的78例患者作为研究对象。其中，男性31例，女性47例；年龄15～52岁。所有患者均符合慢性荨麻疹的诊断标准，近1个月未使用过糖皮质激素和免疫制剂，排除合并其他自身免疫相关性疾病、肝肾功能障碍或感染性疾病及对抗组胺药物过敏。收住院告知研究事项，取得患者知情同意后给予奥洛他定联合卡介菌多糖核酸治疗。

1.2 治疗方法

患者入组后给予奥洛他定联合卡介菌多糖核酸治疗，方法如下：奥洛他定5 mg、口服、2次/d；卡介菌多糖核酸注射液0.7 mg、肌内注射、3次/周。治疗4周后根据疗效酌情减量或停药。

1.3 外周血TLRs表达量的检测

治疗前和治疗后2、4及6周时，采集患者的外周血，加入淋巴细胞分离液后离心，吸取中间悬浮的外周血单个核细胞，PBS洗涤、离心2遍后加入Trizol裂解液并分离细胞中的总RNA，逆转录为cDNA后进行实时荧光定量聚合酶链反应扩增，扩增的目的基因包括TLR2、TLR4、TLR7、TLR9，内参基因为GAPDH，根据扩增曲线计算TLR2、TLR4、TLR7、TLR9的mRNA含量。

1.4 血清指标的检测

治疗前和治疗后2、4及6周时，采集两组患者的外周血，室温静置20 min后离心，分离血清后采用酶联免疫吸附试剂盒测定IgE、补体C3、C4、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）、白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）的含量。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较用LSD-t检验；相关分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后外周血中TLRs的表达量

治疗前和治疗后2、4及6周时，外周血单个核细胞中TLR2 mRNA的含量随治疗时间趋势递减，各时间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；TLR4、TLR7及TLR9的mRNA含量在治疗过程中无变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 治疗前后血清中IgE、C3、C4含量比较

治疗前和治疗后2、4及6周时，血清中IgE的含量随治疗时间趋势递减，各时间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；C3、C4 的含量随治疗时间趋势递增，各时间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 治疗前后血清中Th1、Th2细胞因子含量比较

治疗前和治疗后2、4及6周时，血清中IFN-γ、IL-2的含量随治疗时间趋势递增，各时间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；IL-4、IL-10的含量随治疗时间趋势递减，各时间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 相关性分析结果

外周血单个核细胞中TLR2的mRNA表达量与血清中IgE、IL-4、IL-10的含量呈正相关，与血清中C3、C4、IFN-γ、IL-2的含量呈负相关。见表4。

表1 治疗前后外周血中TLRs mRNA表达量比较 （n =78，±s）

注：1）与治疗前比较，P ＜0.05；2）与治疗后2周比较，P ＜0.05；3）与治疗后4周比较，P ＜0.05

治疗时间 TLR2 TLR4 TLR7 TLR9治疗前 1.08±0.15 1.03±0.13 1.06±0.11 1.03±0.15治疗后2周 0.77±0.061） 1.06±0.12 1.02±0.14 0.96±0.11治疗后4周 0.52±0.072） 0.98±0.11 0.97±0.12 1.01±0.13治疗后6周 0.34±0.043） 1.05±0.14 0.98±0.09 1.05±0.12 F值 14.822 0.251 0.226 0.184 P值 0.000 0.184 0.174 0.232

表2 治疗前后血清中IgE、C3、C4含量的比较 （n =78，g/L，±s）

注：1）与治疗前比较，P ＜0.05；2）与治疗后2周比较，P ＜0.05；3）与治疗后4周比较，P ＜0.05

组别 IgE C3 C4治疗前 126.69±17.85 0.92±0.11 0.32±0.06治疗后2周 56.52±7.521） 1.07±0.121） 0.41±0.061）治疗后4周 33.15±3.642） 1.23±0.151） 0.47±0.071）治疗后 6周 27.65±3.613） 1.42±0.161）2）3） 0.52±0.071）2）F值 22.812 8.582 7.962 P值 0.000 0.001 0.003

表3 治疗前后血清中Th1、Th2细胞因子含量的比较 （n =78，ng/L，±s）

表3 治疗前后血清中Th1、Th2细胞因子含量的比较 （n =78，ng/L，±s）

注：1）与治疗前比较，P ＜0.05；2）与治疗后2周比较，P ＜0.05；3）与治疗后4周比较，P ＜0.05

组别 IFN-γ IL-2 IL-4 IL-10治疗前 11.32±1.52 25.58±3.36 7.64±0.93 10.36±1.42治疗后2周 16.67±2.031） 32.71±4.46 4.58±0.65 7.32±0.92治疗后4周 22.26±3.142） 39.42±5.12 3.32±0.46 5.57±0.71治疗后6周 32.18±4.853） 52.42±6.58 2.71±0.32 4.21±0.56 F值 18.382 12.283 22.182 11.028 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 TLR2 mRNA表达量与血清指标的相关性分析

3 讨论

慢性荨麻疹的发生与B淋巴细胞产生的IgE以及CD4+T细胞中Th2亚群产生的细胞因子IL-4、IL-10有关。IgE能够介导I型变态反应，而IL-4和IL-10等细胞因子对IgE的产生具有正反馈效应。已有研究报道，慢性荨麻疹患者体内IgE、IL-4、IL-10的产生增多，会造成补体C3和C4的不断消耗、抑制Th1亚群的分化成熟及细胞因子的分泌[6-7]。奥洛他定联合卡介菌多糖核酸是目前临床上治疗慢性荨麻疹的常用方案，前者是一类抗组胺药物，能抑制组胺所介导的炎症反应，抑制多种细胞因子的分泌和释放[8]；后者是一类非特异性免疫调节剂，能够稳定肥大细胞、与IgE竞争性结合肥大细胞上的抗原并抑制肥大细胞脱颗粒过程，同时也能调节T淋巴细胞亚群的平衡、纠正Th1/Th2的失衡状态[9]。国内安国芝[3]的研究证实，奥洛他定联合卡介菌多糖核酸治疗慢性荨麻疹能够取得确切疗效。

在慢性荨麻疹的病情发展变化过程中，TLRs家族中的TLR2、TLR4、TLR7、TLR9均被证实与患者体内免疫应答和炎症反应的紊乱有关，是造成慢性荨麻疹发生以及病情发展的关键分子[4-5]。本研究发现，奥洛他定联合卡介菌多糖核酸治疗能够以时间依赖性的方式降低外周血单个核细胞中TLR2的mRNA含量，但是不会影响TLR4、TLR7、TLR9的mRNA含量。这说明奥洛他定联合卡介菌多糖核酸治疗慢性荨麻疹可能主要通过TLR2发挥作用。

IgE是介导慢性荨麻疹患者体内Ⅰ型变态反应的重要抗体，与肥大细胞表面FcεRI结合后能够造成肥大细胞脱颗粒，进而分泌组胺等介质并引起荨麻疹的临床症状[10-11]。在IgE介导Ⅰ型变态反应的过程中，补体C3和C4也发挥重要的协同作用并且会被不断消耗[12]。相关临床研究显示，慢性荨麻疹患者体内IgE的含量升高，而C3和C4的含量降低[13]。本研究结果显示，奥洛他定联合卡介菌多糖核酸治疗能够以时间依赖性的方式降低血清中IgE的含量且与外周血中TLR2的mRNA表达量呈正相关，以时间依赖性的方式增加C3和C4的含量且与外周血中TLR2的mRNA表达量呈负相关。这就说明奥洛他定联合卡介菌多糖核酸治疗可能通过抑制TLR2的表达来减少IgE的分泌以及C3和C4的消耗。

在IgE介导Ⅰ型变态反应的过程中，Th1和Th2细胞对体液免疫应答过程以及自身抗体的分泌均具有调节作用。Th2细胞所分泌产生的IL-4、IL-10能够介导体液免疫应答，对B细胞的分化成熟以及IgE的分泌具有促进作用；Th1细胞所分泌的IFN-γ、IL-2能够介导细胞免疫，对Th2细胞的功能具有抑制作用。相关研究报道，慢性荨麻疹患者体内Th1细胞的功能处于抑制状态、Th2细胞的功能则增强。本研究结果显示，奥洛他定联合卡介菌多糖核酸治疗能够以时间依赖性的方式增加血清中IFN-γ、IL-2的含量且与外周血中TLR2的mRNA表达量呈负相关，以时间依赖性的方式降低IL-4、IL-10的含量且与外周血中TLR2的mRNA表达量呈正相关。表明奥洛他定联合卡介菌多糖核酸治疗可能通过抑制TLR2的表达来调节Th1/Th2免疫应答的平衡，抑制Th2免疫应答、增强Th1免疫应答。

综上所述，奥洛他定联合卡介菌多糖核酸治疗可通过TLR2通路调节慢性荨麻疹患者体内的IgE所介导的Ⅰ型免疫应答，同时也调节Th1/Th2的免疫平衡。

参 考 文 献：

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