组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合HPV16E7—DNA疫苗治疗宫颈癌的效果及机制研究

黄卓敏 李晴 姚秀华 金平

[摘要] 目的 探討组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACI）伏立诺他（SAHA）联合人乳头瘤病毒16 E7-DNA（HPV16E7-DNA）疫苗治疗宫颈癌的效果及免疫机制。 方法 建立TC-1宫颈癌小鼠模型，负瘤第5天，采用随机数字表法将小鼠分为HPV16E7-DNA组、SAHA组、SAHA联合HPV16E7-DNA组、对照组，用药方案：HPV16E7-DNA组给予疫苗5 μg/kg，SAHA组给予SAHA 20 mg/kg，SAHA联合HPV16E7-DNA组给予疫苗5 μg/kg+SAHA 20 mg/kg，对照组给予100 μL磷酸盐溶液（PBS）。每3天1次，共4次。绘制肿瘤生长曲线；流式细胞仪检测各组小鼠外周血CD8+T细胞的数量；体外实验检测不同剂量SAHA（25.0、12.5 nmol/L）对TC-1细胞MHCⅠ类分子H-2Kb表达的影响。 结果 与其他三组比较，SAHA联合HPV16E7-DNA组的肿瘤生长速度明显减慢，小鼠外周血HPV16E7特异性CD8+T细胞的数量增高（P < 0.05）。体外实验结果提示，与对照组比较，SAHA组细胞MHCⅠ类分子H-2Kb的表达明显增高（P < 0.05），低剂量与高剂量SAHA组之间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 HDACI联合HPV16E7-DNA疫苗可能通过上调肿瘤细胞MHCⅠ类分子的表达，激活机体CD8+T细胞免疫反应，从而产生明显的抗肿瘤效应，有望用于宫颈癌的免疫治疗。

[关键词] 组蛋白去乙酰化酶抑制剂；HPV16-E7疫苗；宫颈癌；CD8+T细胞；MHCⅠ类分子

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）02（b）-0018-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of combination of histone deacetylase inhibitor （HDACI） Suberoylanilide Hydroxamic Acid （SAHA） combined with human papilloma virus 16 E7-DNA （HPV16E7-DNA） vaccine in the treatment of cervical cancer and its immunological mechanism. Methods The model of mice with TC-1 cervical cancer was made， then on the 5th day after tumor bearing， the mice were randomly divided into HPV16E7-DNA group， SAHA group， SAHA and HPV16E7-DNA group， control group by random number table method. The therapeutic regimen was as followed： HPV16E7-DNA group was given vaccine 5 μg/kg， SAHA group was given SAHA 20 mg/kg， SAHA and HPV16E7-DNA group was given vaccine 5 μg/kg+SAHA 20 mg/kg， the control group was given 100 μL phosphate solutions （PBS）. Once every 3 days， total for 4 times. The tumor growth curve was drawn； the amount of CD8+T cells in peripheral blood of mice in each group was detected by flow cytometry； the effects of different doses of SAHA （25.0， 12.5 nmol/L） for the expression of H-2Kb of MHC class Ⅰ in TC-1 cells were detected by experiment in vitro. Results Compared with the other three groups， the tumor growth rate in SAHA and HPV16E7-DNA group was significantly slowed down， the amount of HPVE7 specific CD8+T cells in peripheral blood of mice was significantly increased （P < 0.05）. In-vitro experiment showed that compared with control group， the expression of H-2Kb of MHC class Ⅰ in SAHA group was increased significantly （P < 0.05）， while there was no significant difference between low dose of SAHA group and high dose of SAHA group （P > 0.05）. Conclusion HDACI combined with HPV16E7-DNA vaccine comes into significant anti-tumor effects may be through up-regulating expression of MHC class Ⅰ of the tumor cells and activating the immune response of CD8+T cells， which is expected to be used in the immunotherapy of cervical cancer.

[Key words] Histone deacetylase inhibitor； HPV16E7-DNA vaccine； Cervical cancer； CD8+T cells； MHC class Ⅰ

宫颈癌在全球妇女的癌症死因中居第2位，严重威胁女性健康。高危型人乳头瘤状病毒（HR-HPV）是宫颈癌发生的主要病因，HPV16病毒基因E7是主要致癌基因。宫颈癌传统的治疗包括手术、放疗及化疗等，治疗创伤大，不能防止HPV再次感染[1]。以HR-HPVE7为靶点研制治疗性DNA疫苗，将为宫颈癌的防治开辟一条全新的途径，但是DNA疫苗本身的免疫原性弱，单独应用并不能起到良好的抗肿瘤效应[2-3]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACI）与DNA疫苗联合应用，能增加DNA疫苗编码蛋白质的表达，上调MHCⅠ、Ⅱ类分子的表达，从而增强DNA疫苗的抗肿瘤免疫效应[4]。本研究制备HPV16E7-DNA疫苗，联合HDACI类药物伏立诺他（Suberoylanilide Hydroxamic Acid，SAHA）对宫颈癌负瘤小鼠进行免疫治疗，探讨其对宫颈癌的治疗效果及其可能的免疫机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株来源及培养

小鼠宫颈癌细胞系TC-1由美国霍普金斯大学医学院TC WU教授惠赠。细胞培养于含10%小牛血清的高糖DMEM培养基中，置于含5%CO2的37℃培养箱中，0.25%胰酶消化传代，1～2 d更换培养液。

1.2 HPV16E7-DNA疫苗的制备、纯化及检测

以大肠埃希菌作为表达载体，pcDNA3.1（+）作为表达质粒，BamHI/XhoI作为限制性核酸内切酶，构建HPV16E7-DNA疫苗。

1.3 试剂的购买与配制

SAHA购自购于Cayman公司，为白色粉末，使用二甲基亚砜（DMSO）溶液给予溶解稀释备用。抗PE-HPV16-E7四聚体由商业公司合成。FITC-CD8a、抗PE-H2Kb均购自商业公司。药物及试剂的配制及使用按说明书进行。

1.4 宫颈癌负瘤小鼠模型的建立及免疫治疗方案

1.4.1 实验动物 选用健康近交系C57BL/6小鼠，5周龄，雌性，体重20～30 g，购自北京维通利华动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2016-0011。按三级动物要求，饲养在无特定病原体环境中，所用饲料、饮水及垫料均经高压灭菌处理。

1.4.2 动物实验分组及用药方案 于小鼠左侧下腹部皮下注射1×105 TC-1细胞建立宫颈癌模型，负瘤第5天，小鼠下腹部肿瘤大小约0.5 cm。应用随机数字表法将小鼠分为四组（每组10只）：HPV16E7-DNA组、SAHA组、SAHA联合HPV16E7-DNA组、对照组。用药方案：HPV16E7-DNA组给予DNA疫苗5 μg/kg；SAHA组给予SAHA 20 mg/kg；SAHA联合HPV16E7-DNA组给予DNA疫苗5 μg/kg+SAHA 20 mg/kg；对照组给予磷酸盐缓冲溶液（PBS）100 μL。每3天1次，共4次。用药途径：DNA疫苗给予肌内注射；SAHA与PBS给予腹腔注射。

1.5 测量肿瘤生长情况

自负瘤第5天开始，每3天测量肿瘤的最长径（a）和最短径（b）至免疫治疗结束第8天，按a×b2/2公式计算肿瘤体积，取各组平均值。

1.6 流式细胞仪检测小鼠外周血HPV16E7特异性CD8+T细胞的数量

治療结束第8天取小鼠尾静脉血，裂解红细胞，制备单细胞悬液，加入抗PE-HPV16-E7四聚体0.5 μL（0.1 μg）与FITC-CD8a 1 μL（0.2 μg），4℃孵育30 min，流式细胞仪检测HPV16-E7四聚体阳性的CD8+T细胞数量，FlowJo软件进行数据分析。

1.7 流式细胞仪检测SAHA对TC-1细胞MHC1类分子表达的影响

将TC-1细胞悬液转移至6孔平板，细胞浓度为2×105/孔，高剂量SAHA组（25.0 nmol/L），低剂量SAHA组（12.5 nmol/L），对照组（PBS），37℃培养24 h。收集细胞，制成单细胞悬液，加入抗PE-H-2Kb 0.5 μL（0.1 μg），4℃孵育30 min，流式细胞仪检测各组TC-1细胞MHC1类分子H-2Kb的表达，FlowJo软件进行数据分析。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0软件包进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间的比较采用ANOVA方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肿瘤的生长情况

与对照组、HPV16E7-DNA组和SAHA组比较，SAHA联合HPV16E7-DNA组的肿瘤体积20、23 d明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；对照组、HPV16E7-DNA组和SAHA组三组组间肿瘤体积比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 各组小鼠外周血HPV16E7特异性CD8+T细胞数量比较

与对照组、HPV16E7-DNA组和SAHA组比较，SAHA联合HPV16E7-DNA组的小鼠外周血HPV16E7特异性CD8+T细胞数量明显增高，差异有统计学意义（P < 0.05）；对照组、HPV16E7-DNA疫苗组和SAHA组三组组间小鼠外周血HPV16E7特异性CD8+T细胞数量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1～2。

2.3 SAHA对TC-1细胞MHC1类分子H-2Kb表达的影响

與对照组比较，SAHA组细胞MHCⅠ类分子H-2Kb的表达明显增高，差异有统计学意义（P < 0.05）；低剂量与高剂量SAHA组之间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

3 讨论

目前中国每年宫颈癌的新发病例约13万，发病率居世界第二，严重威胁女性健康[5]。以HR-HPV-E7为靶点研发DNA疫苗，对宫颈癌进行免疫治疗，为该类疾病的防治开辟新的途径。DNA疫苗性质稳定，无MHC限制性，可制成多价疫苗，用于治疗多型别HPV感染的宫颈癌。但DNA疫苗的免疫原性弱，而宫颈癌患者的免疫系统处于抑制状态，不能诱发机体产生理想的免疫应答[6]。近年来，学者们通过不同的途径，试图增强HPV-DNA疫苗的免疫原性[7-8]。

宫颈癌细胞MHCⅠ类分子表达下降或缺失，使肿瘤细胞不能为CD8+T细胞识别并杀伤，造成免疫逃逸[9]；HR-HPV病毒本身也能逃避宿主免疫系统的攻击而不被清除[10-11]。因此，提高宫颈癌细胞MHCⅠ类分子的表达是宫颈癌免疫治疗的重要策略。HDACI类药物SAHA，通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤血管生成及转移、降低肿瘤侵袭力等机制发挥抗肿瘤作用[12]。研究表明，SAHA与DNA疫苗联合应用，通过增加DNA疫苗编码蛋白质的表达，上调MHC分子的表达，从而产生免疫治疗效应[13-17]。本研究结果显示，SAHA能提高宫颈癌细胞MHCⅠ类分子H-2Kb的表达；而在低剂量与高剂量SAHA组之间比较，宫颈癌细胞MHCⅠ类分子表达的差异无统计学意义。低剂量SAHA即可上调肿瘤细胞MHCⅠ类分子的表达，说明该药物的作用是非剂量依赖性的，与文献报道相符[18]，其机制有待于进一步探讨。低剂量可减轻药物的不良反应，增加药物的安全性。

本研究显示，SAHA联合HPV16E7-DNA疫苗治疗后，小鼠外周血HPV16E7特异性CD8+T细胞的数量明显升高。HPV16E7-DNA疫苗可激活机体抗HPV16E7特异性CD8+T细胞，而SAHA通过提高肿瘤细胞MHCⅠ类分子的表达，使肿瘤细胞更容易被机体CD8+T细胞识别、捕获和杀伤，SAHA联合HPV16E7-DNA疫苗可产生协同效应，显著增强小鼠HPV16E7特异性CD8+T细胞的增殖活化，及其杀伤肿瘤细胞的免疫反应。最新文献报道，SAHA直接作用于HPV16/18 LCR、E6与E7基因，从而抑制宫颈癌细胞的生长[19-20]。

综上所述，HDACI联合HPV16E7-DNA疫苗用于治疗宫颈癌，可通过上调肿瘤细胞MHCⅠ类分子的表达，激活机体的CD8+T细胞的免疫反应，从而产生有效的抗肿瘤作用。本研究为临床宫颈癌的治疗开拓了新的思路。关于HDACI类药物联合HPV16E7-DNA疫苗应用于宫颈癌免疫治疗的可行性与安全性，仍需进一步的临床试验作深入探讨。

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