沙生柽柳扦插生根过程插穗相关理化特征分析

张锦春，刘有军，王方琳，马俊梅，魏林源，姜生秀

(1 甘肃民勤荒漠草地生态系统国家野外科学观测研究站，甘肃民勤 733300；2 甘肃省荒漠化与风沙灾害防治国家重点实验室，甘肃武威 733000；3 甘肃省治沙研究所，兰州 730070)

沙生柽柳(Tamarixtaklamakanensis)生长于远离河床和湖盆的沙丘上，是中国荒漠地区流动沙丘上最抗旱耐热的固定流沙先锋树种。沙生柽柳在中国干旱荒漠区的生态适应性极强，生态地位显著，生态意义重大[1]。沙生柽柳天然更新由于地下水位的下降受到极大限制，实生苗正日趋减少，实施沙生柽柳引种栽培，为荒漠区防沙治沙植物选育及柽柳灌丛的恢复重建提供新材料，对研究亚洲中部荒漠植物区系特点和本属的系统发育具有重要的科学意义[2]。

沙生柽柳引种栽培已获得成功[3-4]，但种质资源保存研究还较少，种苗繁育技术相对比较薄弱，特别是扦插苗成活率普遍较低，主要原因是插穗萌芽生长后耗尽其营养物质而枯死，扦插生根能力普遍较差[5-6]。因此，开展沙生柽柳扦插繁殖试验，从外源激素诱导、内源物质变化等方面探讨其无性繁殖生根机理，是解决沙生柽柳人工繁育成功的关键所在。目前，林木扦插繁殖方面的报道较多，且多集中于扦插技术[7-8]、形态解剖[9-10]、生理生化[11-14]等方面的研究，对沙生柽柳生根过程虽有初步的试验分析[15]，但有关其扦插生根的理化过程及其生根机理尚不清楚。因此，本试验通过测定沙生柽柳扦插生根过程中内源激素、可溶性营养物质及相关酶活性的动态变化，分析这些内源物质与沙生柽柳生根的关系，探讨沙生柽柳生根机理，以期为沙生柽柳的扦插繁殖提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验地位于甘肃省武威市西郊甘肃省荒漠化与风沙灾害防治国家重点实验室露天试验育苗地。多年平均气温为7.7 ℃，年平均降水量160 mm，年蒸发量2 020 mm，年均日照时数为2 873.4 h，无霜期150 d左右。

1.2 材料扦插、培养与采样

参试材料来源于库姆塔格沙漠北缘沙生柽柳分布区。选取生长健壮且无病虫害的沙生柽柳为采穗母株，采集半木质化的新生枝条作为插条，采集插条充分用水浸泡并用毡布包装后运回试验地。试验前将插条剪制成20 cm长的插穗，插穗上端芽眼上方1 cm处平剪，下端芽眼下方2 cm处斜剪，剪口要求光滑。修剪好的插穗按20根为1捆埋于湿沙中备用，扦插前1 d取出用清水浸泡。试验育苗地整地做低床，床面大小为1 m×6 m，床面覆膜后进行扦插，扦插基质为沙质壤土，用木棍将基质插1小孔，再将插穗插入插孔10～12 cm，插孔用干沙填实后立即浇透底水。插穗扦插株行距10 cm×10 cm，设置3块低床进行重复扦插，每块床面扦插600根，共计扦插1 800根试验插穗。试验插穗扦插后每15 d取样1次，每次随机抽取3块床面各2个插穗混合取样分装3份，即每个时间点取样3次重复。取样时先将插穗样枝洗净擦干，剥取生根处形成层或韧皮部，剪碎混匀称重分装后置于液氮瓶内保存备用。

1.3 测定指标及方法

1.3.1内源激素含量采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定了IAA(吲哚乙酸)、ABA(脱落酸)、ZR(玉米素核苷)和GA3(赤霉素)4种内源激素含量[16-17]。称取备用样品冰浴磨碎，加入预冷样品提取液浸提，离心收集上清液，过C-18固相萃取柱，转入塑料离心管氮气吹干，除去提取液中甲醇，稀释定容。采用Rigol L3000高效液相色谱仪进行测试，进样量10 μL，流速0.8 mL/min，柱温35 ℃，走样时间为40 min，检测波长254 nm。

1.3.2氧化酶活性试验分别测定了样品 PPO(多酚氧化酶)、POD(过氧化物酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、IAAO(吲哚乙酸氧化酶)4种相关氧化酶活性。

(1)PPO活性 采用邻苯二酚比色法测定[18-19]。称取备用样品加磷酸缓冲液冰浴研磨成匀浆，离心收集上清液即为酶液；酶活性测定的反应体系包括pH 5.5的磷酸缓冲液3.9 mL、0.1 mol·L-1儿茶酚溶液1 mL和0.1 mL酶液。以煮过失活的酶液为对照，反应体系加入酶液于37 ℃保温15 min，放入冰浴中加入20%三氯乙酸2.0 mL中止反应，于520 mm波长下测定吸光度A520。以鲜材每分钟A520值变化0.01为1个酶活单位(U·g-1)。

(2)POD活性 采用愈创木酚比色法测定[19-20]。取备用样品加磷酸二氢钾缓冲液研磨成匀浆，离心收集上清液为酶液；酶活性测定的反应体系为0.05 mol/L磷酸缓冲液2.9 mL、2%H2O21 mL、0.05 mol·L-1愈创木酚1 mL和0.1 mL酶液。以煮沸5 min的酶液为对照，反应体系加入酶液于37 ℃水浴中保温15 min，转入冰浴加入20%三氯乙酸2.0 mL中止反应后过滤稀释，在470 nm波长下测定吸光度A470。以鲜材每分钟A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U·g-1)。

(3)SOD活性 采用NBT光化还原法[20]测定。取备用样品加预冷的磷酸缓冲液研磨成浆，离心收集上清液作为粗酶液。酶活性测定的反应体系为0.05 mol/L磷酸缓冲液1.5 mL、750 mmol·L-1NBT溶液0.3 mL、130 mmol·L-1Met溶液0.3 mL、100 mmol·L-1EDTA-Na2溶液0.3 mL、20 mmol·L-1核黄素溶液0.3 mL、酶液0.05 mL和蒸馏水0.25 mL。酶反应体系混匀后置于4 000 Lx日光下反应20 min，同时以不照光的对照管做空白，分别测定测试管的吸光度。以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位(U·g-1)。

(4)IAAO活性 采用比色法测定[18-20]。取备用样品加预冷的磷酸缓冲液研磨成浆，离心收集上清液作为粗酶液。设置样品试管和空白对照试管，样品试管中加1 mL的MnCl2、1 mL的二氯酚、2 mL的200 μg·mL-1IAA、1 mL的酶液和5 mL的磷酸缓冲液，混合均匀；空白对照试管中，除酶液用1 mL磷酸缓冲液代替外，其余成分相同。将试管置于30 ℃恒温水浴中保温30 min，吸取反应混合液2 mL，加入IAA试剂B 4 mL，摇匀置于30 ℃的黑暗处保温30 min，使反应混合液呈红色，将显色后的反应液于530 nm处测定吸光度值 A530，根据A530值从标准曲线上查出相应的IAA浓度，或从直线方程计算反应液中IAA的残留量。用空白对照试管中IAA的量减去样品试管中IAA的残留量，即得被酶分解的IAA的量。以1 mL酶液在1 h内氧化的IAA量(mg)表示酶活性(μg·g-1·h-1)。

1.3.3可溶性糖和可溶性蛋白质含量样品中可溶性糖含量采用葱酮比色法[7,21]测定。取备用样品并加少许80%乙醇磨碎，离心收集上清液，加活性炭脱色后定容。吸取 1.0 mL 提取液，加蒽酮试剂5 mL混合，于沸水浴中煮沸10 min，取出冷却后在 625 nm 波长下测定 吸光度值A625。根据得到的A625值在葡萄糖标准曲线中查找相应的葡萄糖含量，计算样品可溶性糖含量(mg·g-1)。样品中可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250法[7,21]测定。称取备用样加预冷的磷酸缓冲液研磨成浆，离心收集上清液。吸取0.1 mL上清液，加入5 mL考马斯试剂摇匀静置后，放入分光光度计中，595 nm波长下比色，以等量的磷酸缓冲液作为对照。得到的吸光度A595值带入牛血清蛋白标准曲线查找相应的蛋白质含量，依公式计算样品可溶性蛋白含量(mg·g-1)。

1.4 数据处理

试验数据用Excel进行分析并作图，采用SPSS16软件进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 沙生柽柳插穗生根过程中内源激素含量的变化特征

2.1.1内源IAA含量沙生柽柳插穗内源IAA水平在不定根形成过程中出现明显的高低波动变化特征(图1，A)。其中，沙生柽柳插穗IAA含量在扦插后第35天达到最高水平(1.765 5 μg·g-1)，此时插穗内根原基正在形成[15]，说明较高水平的IAA可诱导插穗内根原基形成不定根；插穗扦插后第55天，插穗IAA水平降至最低值(1.089 3 μg·g-1)，此时插穗处于不定根发育期，大量IAA消耗诱导不定根形成；随着不定根根系的生长发育，插穗活力会逐渐增强，在生根后期插穗的IAA含量又有所回升，插穗IAA含量平均为1.509 3 μg·g-1。

不同小写字母表示处理间在0.05水平存在显著性差异,下同图1 沙生柽柳插穗生根过程中内源激素含量变化The different normal letters indicate significant difference among treatmeuts at 0.05 level, the same as belowFig.1 Changes of endogenous hormone contents during adventitious root formation of Tamarix taklamakanensis

2.1.2内源ABA含量沙生柽柳插穗内源ABA含量在扦插生根过程中呈现升高后降低再升高的变化过程(图1，B)。其中，沙生柽柳插穗ABA含量在扦插后15 d内有所增加，可以降低逆境对离体插穗切口的损伤；插穗ABA水平在扦插后第55天保持较低水平(0.884 6 μg·g-1)，这对插穗根源基的形成和插穗生根有利；在扦插80 d左右，插穗不定根已基本形成，其ABA含量升至最高值(1.517 5 μg·g-1)，这与插穗增强自身对周围环境的抗性有关。

2.1.3内源ZR含量沙生柽柳插穗生根过程中，插穗ZR含量呈现低水平向高水平转化趋势(图1，C)。其中，沙生柽柳插穗ZR含量在扦插后55 d内保持较低水平，插穗平均ZR含量为0.817 6 μg·g-1，这是因为随着插穗扦插后根原基的形成，ZR 处于正常的消耗状态；插穗ZR含量在扦插55～80 d内出现明显回升，并达到最高值(1.1783 μg·g-1)，因为此时插穗可自身启动并合成大量的ZR，致使插穗ZR含量升高；在插穗扦插80 d后，随着插穗的生根及生长，其自身可源源不断生成ZR，并用于根系细胞的分裂分化，其ZR含量稍有下降，并达到相对稳定与平衡状态。

2.1.4内源GA3含量沙生柽柳插穗GA3水平在扦插生根过程中总体呈现先升高后降低再升高的变化趋势(图1，D)。其中，插穗GA3含量在扦插后15 d内由1.390 5 μg·g-1增加至1.600 8 μg·g-1，这为根原始体的产生做准备；在扦插15～80 d内，插穗GA3含量持续下降至1.168 9 μg·g-1，此时正处于插穗愈伤组织形成和根原基发生的关键时期，其较低水平的GA3含量有利于促进愈伤组织和根原基的形成，从而促进了不定根的生成；扦插80 d后，插穗GA3含量持续升高至1.661 8 μg·g-1，此时插穗开始不定根形成与发育过程。

2.2 沙生柽柳插穗生根过程中关联酶活性的变化特征

2.2.1PPO活性在沙生柽柳插穗扦插生根过程，插穗PPO活性先升高后下降再升高(图2，A)。其中，插穗PPO活性在扦插初期升高，能够催化植物体内酚类化合物形成有酚酸复合物，有利于插穗根原基的形成和发展，并于扦插15 d后达到峰值(0.607 6 U·g-1)；随着酚类物质的分解，植物体对PPO的需求降低，插穗PPO活性逐渐降低，并于扦插80 d后达到最低值(0.244 7 U·g-1)；随后，插穗根系发育完全，形成单独植株，体内PPO活性逐渐回升。

2.2.2POD活性沙生柽柳插穗POD活性在扦插生根过程中变化明显、升降幅度大(图2，B)。插穗扦插后POD活性就迅速上升，于扦插后第35天达到最高值(4.253 5 U·g-1)；之后，插穗POD活性有所下降，但仍在较长时间内保持较高的活性，其高水平的POD活性有利于不定根的发生；随着插穗根系的形成，插穗POD活性明显回落，下降至1.229 3 U·g-1。

图2 沙生柽柳插穗生根过程中酶活性变化Fig.2 Changes of enzyme activities during adventitious root formation of Tamarix taklamakanensis

2.2.3SOD活性沙生柽柳插穗SOD活性在生根过程中总体上呈现先升高后降低的交替变化趋势，且在扦插生根期间变化较为剧烈(图2，C)。其中，插穗SOD活性在扦插初期较低(220.918 2 U·g-1)，随后迅速升高，并在插后第15天达到最高值(239.777 9 U·g-1)；之后，插穗SOD活性呈快速下降趋势，在扦插第30天时降至最低值(189.094 5 U·g-1)；在扦插第80天时，插穗SOD活性回升至215.988 2 U·g-1；随后，插穗SOD活性基本处于稳定状态。

2.2.4IAAO活性沙生柽柳插穗IAAO活性在生根期间呈现逐渐升高的变化趋势(图2，D)。其中，在扦插前期，插穗IAAO活性最低(1 886.299 9 μg·g-1·h-1)，有利于不定根原基的发生；在扦插35 d后，插穗IAAO活性明显上升至2 379.897 4 μg·g-1·h-1；在不定根诱导过程中，插穗IAAO活性可保持较高水平的稳定状态，使插穗中IAA活性降低，有利于插穗根原基的生长。

2.3 沙生柽柳插穗生根过程中内源营养物质含量变化特征

2.3.1可溶性糖含量沙生柽柳插穗扦插生根过程中，插穗可溶性糖含量呈现先降低后升高的变化过程(图3，A)。其中，插穗扦插0～80 d内，扦插初期插穗生长代谢缓慢，其消耗的糖分也较少，插穗可溶性糖含量呈逐渐下降趋势，具体由扦插时的4.443 7 mg·g-1逐渐下降至扦插第80天的1.767 9 mg·g-1；在插穗扦插80 d后，随着插穗不定根的形成，插穗代谢旺盛，可溶性糖被大量消耗，淀粉酶活性增强，并将大量淀粉分解为可溶性糖，使得插穗内可溶性糖含量迅速升高，插穗生根过程中可溶性糖含量最高可达6.479 9 mg·g-1。

2.3.2可溶性蛋白质含量沙生柽柳插穗可溶性蛋白质水平在生根期间总体上呈现由平缓降低到加速逐渐升高的变化趋势(图3，B)。其中，在扦插前期(扦插0～15 d)，插穗可溶性蛋白质含量由8.431 4 mg·g-1平缓下降至8.197 6 mg·g-1，此时插穗需要消耗少量蛋白质为萌芽生根做准备；在15 d后，插穗内可溶性蛋白质含量开始增加，并随着插穗萌芽生长及其不定根的诱导形成，插穗自身合成能力逐步加强，可溶性蛋白质含量明显逐渐升高，插穗扦插150 d后，插穗已形成新植株，其合成代谢能力明显增强，插穗可溶性蛋白质含量达到最高值(9.113 0 mg·g-1)。

图3 沙生柽柳插穗生根过程中营养物质含量变化Fig.3 Changes of endogenous Nutriments during adventitious root formation of Tamarix taklamakanensis

3 讨 论

植物扦插生根受插穗自身因素和外界环境因子的共同影响。在外界环境一定的情况下，插穗生根的难易主要取决于插穗的营养状况、内源激素含量的变化和相关酶活性的变化等因素。对于营养物质、激素、酶活性与不定根发生之间的关系，不少学者进行过研究。有人认为，激素IAA引起的根原基的发生决定于IAA对RNA和DNA合成的促进作用，从而促进基因的表达，合成相关酶[22]。根原基的发生和发育需要有mRNA的合成，而mRNA将会翻译合成某些特殊的酶，从而促进根原基发生[23]。根原基发生及其不定根形成所合成的RNA、mRNA也需要插穗自身营养物质来提供。也有结果表明，IAA能促进体内POD、PPO、IAAO 等酶的活性变化，从而促进细胞的脱分化，产生愈伤组织[24]。而POD、IAAO等一些氧化酶，能够调节体内IAA水平，在根的形成过程中影响着根原始体的启动与不定根的形成。可见，营养物质的有效利用是启动不定根形成所需能量来源，多种内源激素之间的动态平衡共同调控着不定根的发生与发展，同时一些生长激素还能促进相关酶的活性来影响插穗生根。

内源激素对不定根形成的影响众说纷纭。大量试验证明，内源激素促根生长是基于多种激素之间的动态平衡，从而调控着不定根的发生过程[25-26]。其中，生长素IAA的影响最为普遍，在不定根形成过程中起关键作用；脱落酸ABA则抑制IAA运输和离体器官的生长，对植物扦插生根起着抑制作用；细胞分裂素ZR主要调控细胞的分裂与分化，而赤霉素GA3抑制插穗不定根的形成。本试验结果表明，内源激素IAA、ABA、GA3、ZR消长变化共同影响着沙生柽柳插穗不定根的形成和发育。其中，插穗IAA含量在脱离母体后稍有下降，扦插35 d时保持最高水平，对诱导根原基形成起到关键作用，扦插55 d后IAA诱导消耗则呈现最低水平，说明IAA与不定根的发生密切相关；插穗ABA、GA3含量呈现先升高后降低再升高的趋势，扦插后的小幅度升高可调节离体插穗对逆境的适应，并为根原基的产生做准备，随后内源ABA、GA3含量持续降低，表明低水平ABA、GA3有利于根原基分化和根的形成；插穗ZR含量在不定根形成前激素水平普遍较低，对促进不定根发育有利，不定根形成后ZR含量明显升高，这与其参与根细胞分裂分化有关。总体而言，沙生柽柳插穗扦插55 d后内源激素水平普遍较低，这与插穗不定根形成期相对应，不定根诱导期IAA 水平最高，而GA3、ABA、ZR含量降低是促进插穗生根的重要原因。可见，IAA 是促进不定根形成的主要内源激素，GA3、ABA是不定根形成的抑制剂，而高水平ZR主要参与了根细胞的分裂分化过程。

酶的活性在植物的生长、发育中具有重要作用，并与植物不定根的发生和发展有着密切的关系。POD、IAAO都是与生根关系非常密切的氧化酶，能够调节体内IAA水平，在根的形成过程中影响着根原始体的启动与不定根的形成；SOD是植物抗氧化系统中的关键酶，可催化体内O2-转化为H2O2，从而减轻自由基对植物的毒害作用[27]；PPO可催化酚类物质和IAA形成一种“IAA-酚酸复和物”，能促进不定根形成的活性[28]，催化生长素的代谢，促进不定根的发生与发育[29]。本试验结果表明，沙生柽柳插穗POD活性在扦插前期升高而后期降低，这与难生根植物插穗POD活性变化过程相一致[30]；而柽柳插穗IAAO活性在扦插前期低后期高，并不断调节着插穗内源IAA水平，符合低浓度IAA有利于生根，高浓度IAA促进不定根生长和伸长的观点[31-32]；柽柳插穗SOD活性随着插穗逆境状态的不同而剧烈变化，扦插初期插穗脱离母株的逆境状态导致其活性迅速升高，之后随着不定根产生和生长逆境状态逐渐缓和而降低；插穗PPO活性在沙生柽柳扦插生根过程中相继出现峰值和谷值，在扦插初期升高可能导致生根促进因子“IAA-酚酸复合物”相继增多，有利于根源基的发育和不定根的诱导[33]，随着插穗不定根的形成和酚类物质的分解，插穗PPO需求降低，其PPO活性降低。可见，沙生柽柳插穗生根与其POD、IAAO、SOD、PPO活性密切相关，在扦插的不同时期各自呈现一定的规律性，表明它们在生根过程中的作用可能是既独立又相互联系，并可能通过相互作用来影响生根。

植物生根是一个需要消耗大量营养物质和能量的过程[34]。可溶性糖不仅是生根生长所不可缺少的营养物质，也是插穗生根前维持其生存的主要能源，植物生根过程通常包括插穗生根前营养物质消耗过程和生根后光合所产生的能量积累过程[35-36]，而沙生柽柳插穗生根前后可溶性糖含量动态变化与其营养物质消耗与积累过程相吻合，但因沙生柽柳扦插生根过程相对较长，随着插穗可溶性糖的不断消耗，插穗营养耗尽使其生根受阻，因此，插穗不定根形成期适当增加营养成分有助于提高插穗的成活率；可溶性蛋白能够调节细胞生长及其分化，不仅是植物细胞的主要组成成分，也是植物代谢与细胞分裂的主要物质[37]。有研究表明，植物插穗可溶性蛋白含量的变化趋势通常呈现先升高后降低的变化过程，即生根前插穗蛋白质积累过程及其生根后可溶性蛋白质的转化与消耗过程[38-39]。本试验中沙生柽柳插穗可溶性蛋白质含量的变化并不明显，除扦插初期稍有下降外，插穗生根过程中可溶性蛋白质存在积累过程，且随着插穗生根明显提升并趋于平衡，这可能与植物生根后期营养物质转化成可溶性蛋白质或其参与细胞生长调节与分化有关。

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