菌种保藏方法研究

钟 杰，左泽彦

(1.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省产品质量监督检验院，贵州 贵阳 550016)

现阶段，越来越多的菌种被人们发现并运用到食品、医疗、化工等各个领域。随着对菌种的深入研究和运用，人们逐渐发现菌种和现代人们的生活息息相关。为了使从自然界分离得到的优质菌株能够得以持久利用，菌种的保藏方法必然成为研究的重点，这样才能使具有优质性能的菌株最大程度的发挥作用，更为重要的是在菌种保藏过程中菌种原有的特性不会改变或改变很小，这对微生物的研究具有极大促进作用。

世界各国非常重视微生物菌种的保藏工作。菌种保藏研究始于1890年，但直到1906 年，各国才相继建立了菌种保藏机构。相比，中国的菌种保藏机构于20世纪50年代才开始建设， 直到1979 年正式成立6 个专业性保藏管理中心[1]。研究和选择一种适宜的保藏方法成为各国学者研究的重要工作[2]。

1 菌种保藏的原理

菌种保藏的原理是根据菌种特有的生理生化特性，人为制造低温、干燥、缺氧的环境使菌种保持原有的性状不发生变异或变异很小，终止其繁殖，使代谢降到最低，从而达到半休眠，甚至是完全休眠的状态。对菌种进行保藏的最终目标就是降低菌种的死亡、变异、污染，保持菌种的活性[3]。

2 常用的菌种保藏方法

2.1 定期移植法

定期移植也叫继代保藏法，就是将菌种接种到适合生长的培养基上生长至成熟或产生孢子时，做好标记和记录，放置于低温2～10℃，实验室通常放置于4℃冰箱进行短期的菌种保藏。

定期移植法是当前实验室使用最多的短期保藏菌种的方法。

2.2 甘油法

甘油法是在无菌环境中利用无菌生理盐水将菌种制备成菌悬液，再用浓度为40%～50%甘油经灭菌处理后作为保护剂，保护菌种在冻融过程中不破坏原生质层和细胞膜，菌液和甘油等量加入到灭菌的离心管中，做好标记和记录，放置与-20℃冰箱或-80℃超低温冰箱，可保藏3～5年，柳洪洁[4]对甘油保藏法进行了改良，用灭菌的肉汤代替生理盐水制备菌悬液，取得了更好的保藏效果。甘油保藏法是实验室进行长期保存菌种的主要方法之一。虽然定期移植方法简单，但需要经常移植，移植的过程中会发生染菌、变异等问题，所以长期保藏菌种可采用甘油法。

2.3 干燥保藏法

干燥保藏法也叫载体保藏法，是利用各种方法将菌种吸附在载体上，将菌种用来生长繁殖的水分除去，使菌种代谢将至最低变为休眠状态，但又能保持菌种原有的特性。根据载体不同，干燥保藏法主要有沙土管保藏法、滤纸保藏法、明胶片保藏法、硅胶保藏法、麸皮保藏法等。其中沙土管保藏法、滤纸保藏法、明胶片保藏法使用最多，以下以沙土管保藏法说明。

取河沙与黄土经过多次的过筛处理，用酸去除有机质，然后用纯化水冲洗至中性，烘干备用。按照沙与土3∶2的比例混合放在沙土管中，进行2～3次的高温灭菌，将要保藏的菌种或孢子放于沙土管中，用真空机抽干管内的水分，放于4℃冰箱可保藏5～7年。

2.4 冷冻干燥保藏发

冷冻干燥也叫冷冻真空干燥保藏法。主要步骤是将菌种制成悬浮液，加入保护剂(如甘油)，在-45℃左右的低温环境中快速冷冻，然后在真空减压环境中使水分升华，从而营造一个不宜菌种生长而又能长期保藏的环境。

冷冻干燥保藏法是专业机构保藏菌种使用最多的的方法。该种方法结合了多种保藏菌种的特点，将保藏环境控制在低温、缺氧、干燥状态，同时还添加保护剂减少了在保种对菌种的伤害，多重有利的环境因素抑制了菌种的生理活动，使菌种处于休眠状态，这种方法适用于丝状真菌、细菌、放线菌、病毒等，保藏时间可达10～20年，甚至更久的时间。

2.5 液氮超低温保藏法

液氮超低温保藏法是将需要保藏的菌种和保护剂按一定的比例放于冻存管中，再将冻存管保藏在(-196～-150℃)的超低温液氮中，常用的保护剂有甘油、血清蛋白、二甲基亚矾、聚乙烯氮戊环、糊精、吐温80 等，不同的菌种要根据自己的特性选择不同的保护剂。

液氮超低温保藏法是国际上保藏菌种常用的方法，是目前保藏菌种最理想的方法。在超低温环境中菌种丧失了代谢功能，保持了菌株原有的性状，变异的可能性也大大降低，这种方法对大部分菌株都适用，且保存时间长达5～8年。

表1 常用菌种保藏方法优缺点

3 菌种退化的原因及复壮措施

3.1 菌种退化

菌种在长期的保藏中受外界因素或自发突变造成菌种某些优良性能的衰退，称为菌种退化。菌种退化严重影响菌种的特性和质量，了解和掌握菌种退化的原因和复壮措施是为了保持菌种的优良性状及生活力强的特性。

3.2 菌种退化的原因

导致菌种的退化的因素有很多，有自发突变，也有外界因素的影响。主要因素有遗传物质变异、基因突变、培养环境不适、保藏方法不当、菌种混杂、病毒感染等等。

3.3 复壮措施

在长期的保藏过程中，菌种因多种因素的影响，变异和衰退的现象时有发生，为了维持或恢复菌种原有的优良性状，通常都要给菌种进行复壮处理。常用的菌种复壮的方法主要有菌种纯化、更换适宜的培养基、菌丝尖端分离、控制菌种的传代次数及采用适宜的保藏方法等。下面对各种复壮措施进行介绍。

菌种纯化：为了使菌种复壮，菌种纯化是常用的一种复壮方法。原理是定期分离菌种，将退化的菌种分离出来，挑选出具有优良性状的菌株在适宜的培养基上培养，恢复菌种原有的生长发育，再而进行扩大培养[5]。

更换适宜的培养基：菌种在培养过程中因为代谢物的增加，导致生长环境的改变，菌种长期处于不利环境时就会出现退化，更换适宜的培养基就有可能使菌种恢复原有的生长状态。该方法是最简单使菌种复壮的方法，但对很多退化的菌种不适合。

菌丝尖端分离：挑取健壮菌丝体顶端部分，进行纯化培养，以保持菌种的纯度，使菌种恢复原来的生活力和优良种性，达到复壮的目的[6]。

控制菌种的传代次数：菌种在多次传代过程中会发生少量基因的突变，到突变达到一定程度时，就会造成遗传物质的改变，然而频繁无性繁殖一般都是负变异占绝对优势[7]。因此，控制菌种的传代次数也是防止菌种退化和维持原有性状的有效措施之一。

采用适宜的保藏方法：菌种在保藏过程中，由于方法不当会使菌种生理、生化发生改变，导致代谢减弱或混乱，从而发生菌种退化。对于这种情况，采用合适的保藏方法将会使菌种再次恢复到原有状态，使菌种复壮。

4 讨论

由于菌种的特性不同及菌种保藏方法的优缺点各异，因此，在选择菌种保藏方法时应充分考虑菌种的特性、保藏的目的、实验室设施条件及经济效益，选择最适宜的菌种保藏方法。选择合理的菌种保藏方法，充分维持菌种的活性及纯度，才能发挥菌种应有的价值，提高科研的可信度，与此同时，掌握菌种退化的原因和复壮的措施，避免菌种在长期的保藏过程中丢失原有的优良性状。

[1]顾金刚,姜瑞波. 微生物资源保藏机构的职能、作用与管理举措分析[J].中国科技资源导刊,2008,40(5):53-57.

[2]穆 婷,封艳艳,宋 珉,等. 药品微生物检验用菌种保藏方法简论[J]. 母婴世界,2015,3(6):361-362.

[3]刘文丽,程 池,姚 粟,等. 韩国食品用微生物菌种管理现状[J].食品与发酵工业,2015,41(11):237-242.

[4]柳洪洁. 动物微生物学实验菌种保藏与管理[J].实验科学与技术,2014,12(3):26-28.

[5]赫朝灿.菌种退化的原因、处理措施及菌种保藏探析[J].生物技术世界,2015(2):1.

[6]佚 名.菌种保藏方法及复壮技术[J].吉林蔬菜,2017(6):34-35.

[7]李 红,肖千明，刘 娜，等. 食用菌菌种退化原因分析及复壮方法的探讨[J]. 辽宁农业科学2010(5)：57-59.

(本文文献格式：钟杰，左泽彦.菌种保藏方法研究[J].山东化工,2018,47(7):60-61.)