河南省鸡源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

艾伟昌 ，方忠意 ，李金磊 ，董 鹏 ，狄元冉 ，高延玲 ，吴志明 ，王 璐 ，刘振阳

（1．河南省野生动物救护中心，河南 郑州 450044；2．河南省兽药饲料监察所，河南 郑州 450008；3．河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002）

大肠杆菌（Escherichia coli）是人和动物肠道内的常驻菌，一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性，尤其易引起婴儿和幼畜（禽）严重腹泻和败血症。已经发现的致病性大肠杆菌可分为产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、产vero细胞毒素大肠杆菌（VTEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠侵袭性大肠杆菌 （EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）和尿道致病性大肠杆菌（UPEC）等。

鸡大肠杆菌病是由大肠杆菌（E．coli）的某些致病性菌株所引起的多种疾病的总称，也是对养鸡业危害严重的一种细菌性疾病，临床症状以及典型病理多变化，经常同病毒性疾病和其他细菌性疾病并发感染，给养鸡业造成严重的经济损失。临床上主要应用喹诺酮类、氨基糖苷类、β-内酰胺类药物对大肠杆菌病进行预防和治疗。近些年由于抗菌药物的广泛使用、不合理应用，使得肉鸡体内大肠杆菌耐药菌株出现与耐药谱不断扩大［1］，普遍存在的细菌耐药性与抗菌药物的选择压力有关［2］，耐药菌株的不断出现已成为严重危害人类健康的公共卫生问题。

该研究对河南省4个地区的规模化养鸡场抽取样品进行大肠杆菌分离、鉴定，随后进行耐药性试验。初步掌握了河南省鸡源大肠杆菌的耐药情况，为进一步防控鸡源大肠杆菌病提供了重要的理论依据和临床试验资料，为指导养殖户临床合理用药提供了参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源：2017年1—11月抽取郑州、开封、焦作、许昌4个地区规模化鸡场肛门拭子样品120批。具体抽样数量见表1。

表1 2017年样品抽样数量统计

1.1.2 标准菌株：大肠杆菌标准菌株ATCC 25922，购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 培养基与试剂：一次性无菌采样棒（BPW），购自郑州君越科莱特健康科技有限公司；麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、营养琼脂购自北京路桥技术有限公司；革兰氏阴性细菌鉴定板购自BD公司。

1.1.4 仪器设备：低温摇床—数字SHKE6000-8CE（Thermo Fisher Scientific），细菌浊度仪（北京中西远大科技有限公司）；全自动细菌鉴定/药敏系统（BD PhoenixTM-100）。

1.2 试验方法

1.2.1 预增菌：将一次性无菌采样棒采集的样品尽快送到实验室，（36±1）℃培养 16～20 h， 同时设阳性对照和阴性对照。

1.2.2 样品的分离纯化及鉴定：取预增菌菌液1～2环，划线于伊红美蓝琼脂或麦康凯琼脂上，（36±1）℃培养16～20 h，选取单个典型菌落进行纯化，最后将纯化好的菌落划线接种于营养琼脂培养基，采用全自动细菌鉴定/药敏系统进行鉴定。

1.2.3 药敏试验：取营养琼脂上经鉴定的大肠杆菌，用生理盐水调制0.5 MCF，吸取10 μL加入到肉汤中，然后分别取100 μL加入到96孔药敏板中，（36±1）℃培养 16～20 h，读取药敏试验结果。

2 结果与分析

2.1 菌株分离结果

经预增菌、大肠杆菌选择性培养基的分离纯化，最后经全自动细菌鉴定/药敏系统鉴定，河南地区规模化鸡场共分离大肠杆菌100株，总体分离率为83.3%（100/120）。其中郑州地区分离率最高，为100%（30/30）；焦作地区分离率次之，为90.0%（27/30）；开封、许昌地区分离率相对较低，分别为 76.7%（23/30）和 66.7%（20/30）。 具体结果见表2。

表2 2017年河南省鸡场大肠杆菌分离情况

2.2 药敏试验结果

分离的100株大肠杆菌，对四环素、氨苄西林、磺胺异噁唑、恩诺沙星、复方新诺明的耐药率较高，分别为 88.0%、87.0%、86.0%、85.0%、81.0%；对氧氟沙星、强力霉素（多西环素）、氟苯尼考、头孢噻呋中度耐药，耐药率在40.0%～80.0%；对多黏菌素E、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、美罗培南较为敏感，耐药率均在20%以下。具体结果见图1、表 3。

2.3 不同地区耐药结果

从不同地区来看，耐药结果存在明显差异：郑州地区鸡源大肠杆菌对氨苄西林、恩诺沙星、氧氟沙星耐药率明显低于其他3个地区，其中对氧氟沙星耐药率低于其他3个地区45%以上；开封地区大肠杆菌对磺胺异噁唑、复方新诺明、氟苯尼考耐药率明显低于其他3个地区，其中对磺胺异噁唑的耐药率低于其他3个地区40%以上；焦作地区大肠杆菌对强力霉素、氟苯尼考、大观霉素、庆大霉素、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶的耐药率明显高于其他3个地区，其中对大观霉素的耐药率高于其他3个地区45%以上；许昌地区大肠杆菌对强力霉素、头孢噻呋的耐药率明显低于其他3个地区；郑州、焦作两地区大肠杆菌对四环素、多黏菌素E的耐药率明显高于开封、许昌地区。具体结果见图1、表3。

2.4 多重耐药结果

总体来说，分离的100株鸡源大肠杆菌多重耐药严重，3耐及3耐以上菌株占84.0%，多重耐药主要集中于3～6耐，占77.0%，其中3耐最多，占28.0%。其中，郑州地区3耐及3耐以上菌株占83.3%，3耐最多，占26.7%；开封地区3耐及3耐以上菌株占78.3%，3耐最多，占30.4%；焦作地区3耐及 3耐以上菌株占 85.2%，3耐最多，占33.3%；许昌地区3耐及3耐以上菌株占90.0%，4耐最多，占40.0%；具体结果见图2。

3 结论与讨论

养殖户用药过程中选药、剂量、疗程不当，严重滥用药物（不少养殖户在未确定病因的情况下，大量使用不同种类的抗菌药物）等行为均可导致耐药菌株的产生。大多数鸡场的大肠杆菌存在着广泛的耐药性，给药物治疗带来很大的难度。

图1 2017年河南省鸡源大肠杆菌对16种抗菌药物的耐药情况

表3 2017年河南省规模鸡场大肠杆菌耐药情况 %

图2 2017年河南省鸡场大肠杆菌多重耐药结果

该试验从河南省4个地区抽取样品120批，共分离鸡源大肠杆菌100株，分离率为83.3%。该结果比孙蓉蓉［3］等从发病水貂中分离大肠杆菌的分离率［为 35.7%（10/28）］要高，比孙刚全［4］等从猪鸡粪便中分离大肠杆菌的分离率［为100%（15/15）］要低，表明不同动物来源、不同采样部位及动物不同健康程度大肠杆菌的分离率存在差异。

分离菌株对四环素、氨苄西林、磺胺异噁唑、恩诺沙星、复方新诺明的耐药率均超过80%，对氧氟沙星、强力霉素（多西环素）、氟苯尼考、头孢噻呋耐药率在40%～80%，4个地区之间耐药结果存在差异。该研究中鸡源大肠杆菌对磺胺异噁唑、复方新诺明、多西环素、大观霉素的耐药率分别为86.0%、81.0%、66.0%和 39.0%，比宁昆等［5］的研究鸡源大肠杆菌对磺胺异噁唑、复方新诺明、多西环素、大观霉素的耐药率 （分别为100%、91.7%、87.5%和70.8%）要低；而对恩诺沙星、头孢噻呋耐药率（分别为85.0%和54.0%）比其结果（58.3%和41.7%）要高。比张彬［6］等从腹泻鸡病料中分离的大肠杆菌对强力霉素的耐药率（为91.0%）要低。该研究分离的大肠杆菌对庆大霉素的耐药率为38.0%，比朱二勇［7］等从诊断为子宫内膜炎的患牛中分离的大肠杆菌对庆大霉素的耐药率 （为11.8%）要高；而对复方新诺明的耐药率比其研究耐药率（为95.9%）要低。该试验结果对四环素的耐药率为88.0%，比蒲承君［8］等研究鸡源大肠杆菌对四环素的耐药率（为100%）要低，表明不同地区、不同用药情况以及动物健康状况不同其耐药结果也存在差异，该结果和肖利君［9］的研究结果一致。大肠杆菌在不同地区的耐药性差异较大，在临床应用时，要因地制宜，切勿乱用药。

从多重耐药情况来看，河南省鸡源大肠杆菌多重耐药情况严重，3耐及3耐以上菌株占84.0%，该结果比植婵萍［10］等的研究——有机农场鸡源大肠杆菌3重耐药及以上所占比例为56.4%要高；同饶丽丽［11］等的研究屠宰前鸡源大肠杆菌9重耐药比例最高（为19.20%），存在差异，表明不同环境其用药情况存在差异，大肠杆菌多重耐药情况不同。

从该试验结果来看河南省鸡源大肠杆菌的耐药现象已相当严重。在今后的养殖生产中应加强消毒，加强饲养管理，科学合理地使用抗生素，选用中草药或生物制剂进行治疗，必要时进行药敏试验，选择敏感性药物进行针对性治疗。同时注意交叉用药和联合用药，逐步减少鸡源大肠杆菌的耐药性的产生。

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［1］王影，李欣南，韩镌竹，等．某肉鸡场鸡源大肠杆菌耐药性跟踪检测与分析 ［J］.中国畜牧兽医，2015，42（12）：3329-3337．

［2］王影，李欣南，韩镌竹，等．大肠杆菌耐药性产生与传播机制研究现状［J］.现代畜牧兽医，2016（1）：32-37．

［3］孙蓉蓉，邹玲，刘文华，等．水貂大肠杆菌的分离鉴定及 药 敏 试 验 ［J］. 安 徽 农 业 科 学 ，2015，43 （11）：119，126．

［4］孙刚全，敖光第．重庆一例猪源及鸡源大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验［J］.四川畜牧兽医，2014（12）：26-28．

［5］宁昆，沈莉萍，王晓旭，等．上海市动物源性大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验［J］.中国动物检疫，2016，33（9）：23-26．

［6］张彬，韩志霞，马金玉，等．河南省部分地区鸡大肠杆菌的分离鉴定及耐药性研究 ［J］.河南农业科学，2015，44（2）：127-131．

［7］朱二勇，殷丽霞，曲立春，等．黑龙江鸡西地区奶牛子宫内膜炎病原菌分离鉴定及耐药性研究［J］.畜牧与饲料科学，2014，35（2）：18-19．

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［9］肖利君．大肠埃希菌临床感染的分布及耐药性分析［J］.实用预防医学，2011，18（2）：345-347．

［10］植婵萍，郭小婷，姚旭，等．有机农场鸡、猪源大肠杆菌耐药性研究［J］.中国畜牧兽医，2015，42（12）：3351-3357．

［11］饶丽丽，罗东妹，陈佩玲，等．屠宰前鸡、猪源大肠杆菌耐药性调查［J］.中国畜牧兽医，2014，41（7）：225-229．