多浪羊不同时期卵巢蛋白提取效果研究

钱 伟， 王娟红， 贺建忠， 陈宏伟， 郑毛亮， 常卫华

(1.塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300 ；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室， 新疆 阿拉尔 843300)

多浪羊具有常年发情的优良特性，一年四季均可发情，受长、短日照规律的影响较小，而大部分品种绵羊为季节性发情，受日照规律的影响较大，一般只在夏秋季节发情。 在规模化、集约化养殖趋势下，最大限度挖掘家畜的繁殖潜力是经济效益的追求所在，而季节性发情明显限制了羊繁殖潜能的发挥。 目前对绵羊常年发情和季节性发情的分子遗传机制还不是很清楚，只是对季节性发情的主要生理途径有个大致了解。 无论是非细胞生物的病毒，还是具有细胞结构的真核生物及原核生物，其遗传物质发挥作用的最终执行者均为蛋白质，蛋白质的功能与活性决定了生物体活动的所有方面[1]。 有报道在黄体期，大量蛋白如血浆铜蓝蛋白，乳铁蛋白，DMBT1 及PIGR 与免疫系统有关，CD9 和腓骨蛋白均与组织重构有关，而且myosin 9 和纤维连接蛋白在发情期和黄体明显不同[2-3]。 随着蛋白质提取技术和蛋白质组学技术的迅猛发展，学者对蛋白质作用机制及功能的认识逐渐加深。 在整个蛋白质研究过程中，蛋白质的正确提取和分离是最重要的一环，尤其是高质量蛋白的提取。 机体中的蛋白质通常具有种类繁多、性质差异大等特性，即使属于同一类蛋白，同一种组织，但不同生理期、提取方法、提取效果也可能大不相同，蛋白提取优劣严重影响蛋白组学后续试验，比如同位素标记相对和绝对定量试验。 该技术在多浪羊常年发情功能蛋白的挖掘上具有非常重要的意义[4-6]。

试验利用超声破碎对多浪羊发情期、发情间期和妊娠期卵巢进行蛋白提取，通过质量检测比较多浪羊不同生理时期卵巢蛋白提取效果，对卵巢组织或细胞内的蛋白组成、表达水平、修饰情况等进行系统分析，为多浪羊常年发情调控机理的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 取发情期、发情间期和妊娠期多浪羊(塔里木大学动物试验站饲养)屠宰后立即取出卵巢，并用PBS 冲洗(pH 值7.4)组织表面，之后迅速投入液氮进行快速冷冻，并带回实验室-80 ℃保存备用。

1.2 主要药品与试剂 尿素、硫脲、SDS、考马斯亮蓝G-250、β-巯基乙醇、琼脂糖、丙烯酰胺、蛋白酶抑制剂混合物等，购自Sigma 公司；NH4HCO3、Bradford 试剂、BSA 和蛋白Marker，购自Amresco 公司；其余常规试剂，购自新疆宝信生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同时间卵巢组织蛋白提取 分别取发情期、发情间期和妊娠期多浪羊卵巢0.1 g，加0.4 mL的蛋白裂解液(8.0 mol/L 脲、50 mmol/L NH4HCO3、1 ×蛋白酶抑制剂)进行超声破碎，设置为每次2 s，间隔10 s，共5 min，整个操作在冰上进行。 超声破碎物在冰上放置20 min 后，10，000 r/mim(4 ℃)离心30 min，取上清转入新管，然后将蛋白提取液分装，-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 Bradford 蛋白定量和标准曲线的绘制 采用Bradford 法对蛋白进行定量[7-8]，先将已知含量的BSA 配成不同浓度的蛋白溶液，分别测定其显色后的光吸收值(OD 值)，根据OD 值与蛋白浓度之间的线性关系，绘制出蛋白浓度标准曲线，然后测定待测蛋白溶液显色后的OD 值，参照BSA 标准曲线计算待测蛋白浓度。 所有操作步骤均在室温状态下完成。

分别取BSA 8 μg、10 μg、12 μg、14 μg、16 μg、18 μg 配成不同浓度的蛋白溶液，并测定吸光值，如果相关性R2＜0.95，标准曲线不能用于计算，重新进行试验。 根据计算配置蛋白溶液，总体积为20 μL；同时准备被检样本1.0 μL，与19 μL 水混合，加入检测酶标板，每个样本检测2 个复孔。 每个复孔加入200 μL Bradford 工作液，轻微吸打混匀。避光，室温静止放置15 min。 用酶标仪检测，检测波长设定在595 nm。 根据标准曲线推导出检测蛋白的总量，并计算相应浓度。

1.3.3 SDS-PAGE 检测蛋白完整性 选玻璃板光面，用擦镜纸蘸无水乙醇擦净残留污渍，并放置板夹上方，制备约12%分离胶(超纯水26 mL、30%丙烯酰胺(29∶1)32 mL、1.5 mol/L Tris -HCl 20 mL、10% SDS 0. 8 mL、 10% APS 0. 8 mL、 TEMED 0.04 mL)80 mL，约10 -15 min SDS - PAGE 胶凝固。 各取15 μg 蛋白质样品5∶1 (v/v)加入5 ×上样缓冲液，沸水浴5 min，14 000 r/min 离心10 min取上清，进行12% SDS-PAGE 电泳。 电泳条件：恒流14 mA，电泳时间90 min。

电泳结束后取出PAGE 胶，超纯水冲洗3 ～4次。 然后将冲洗干燥的PAGE 放入托盘用考马斯亮蓝进行染色，用封口膜封住托盘后置与水平摇床上；染色结束后，用超纯水冲洗胶片3 次，然后进行脱色至胶片背景为无色。 质检判定标准如下：

A 类：质检合格，蛋白条带清晰、完整、均一，蛋白无降解，蛋白总量可以满足2 次或者2 次以上试验(iTRAQ 试验：蛋白总量≥400 μg，Label Free 试验：蛋白总量≥120 μg)；

B 类：质检合格，蛋白条带清晰、完整、均一，蛋白无降解，蛋白总量可满足1 到2 次试验(iTRAQ 试验：400 μg ＞蛋白总量≥200 μg，Label Free 试验：120 μg ＞蛋白总量≥60 μg)；

C 类：质检合格，蛋白条带有一定程度弥散，或蛋白有一定程度降解，蛋白总量满足至少一次的试验要求(iTRAQ：200 μg ＞蛋白总量≥100 μg；Label Free 试验：60 μg ＞蛋白总量≥40 μg)，结果有一定的试验风险，如需继续试验，需要客户有风险准备；

D 类：质检不合格，蛋白条带清晰、完整、均一，蛋白无降解，但总量不满足1 次试验要求(iTRAQ：蛋白总量＜100 μg；Label Free：蛋白总量＜40 μg)，需要重新提供样品。

1.3.4 凝胶扫描 PAGE 胶染色脱色后，用图像扫描系统(Bio -Rad)对凝胶进行图像扫描。 扫描模式为256 灰阶透视扫描，分辨率为600 dpi。 扫描完的凝胶用保鲜膜包好编号后置于4 ℃冰箱中保存，对扫描图像进行结果分析。

2 结果

2.1 标准曲线 该试验用Bradford 方法对发情期、发情间期和妊娠期多浪羊卵巢全蛋白质含量进行测定，1 mg/mL BSA 溶液作标准液制作标准曲线，标准曲线见图1，y = 0. 033 5x + 1. 034 5； R2=0.964，由标准曲线公式可知，标准曲线相关系数为0.964，线性关系良好，可以用于多浪羊卵巢全蛋白质量的测定。

2.2 多浪羊卵巢全蛋白提取定量及SDS - PAGE电泳检测结果 根据标准曲线，对发情间期、发情期和妊娠期多浪羊卵巢全蛋白质含量进行，定量结果见表1，其浓度均在8 -15 μg /μL 之间。

图1 BSA 标准曲线

SDS-PAGE 电泳检测结果见中插彩版图2，从图2 可看出，3 个时期，每个时期2 个重复，6 个样品总蛋白在25 ～200 kDa 分子量范围内得到有效分离。 蛋白条带清晰、完整，蛋白无降解。 其中60 kDa左右LLY-4 和LLY -5 与其他四例样本在该位置的蛋白丰度有些微差异。 根据判定标准：蛋白条带清晰、完整、均一，蛋白无降解，蛋白总量可以满足2次或2 次以上试验，质检合格，均为A 类，可以满足后续iTRAQ 试验。

表1 多浪羊不同时期卵巢蛋白含量定量

3 讨论

绵羊卵巢结构复杂，富含脂类及其他干扰物质，到目前为止，尚未建立一种标准化绵羊卵巢全蛋白的提取方法[9]，而且试验蛋白样品制备的好坏被认为是蛋白质样品能否成功分离的关键步骤[10]，只有提取合格的高质量蛋白才能为动物组织特殊生理功能蛋白的研究提供基础，因此组织蛋白提取方法、提取过程的优化或不同组织蛋白提取过程的建立仍是必须的。 Jia 等[11]以绵羊卵巢组织为研究对象，建立了卵巢蛋白双向凝胶电泳(2 -DE)最佳体系，对卵巢蛋白提取与处理、样品上样量以及等点聚焦电压、时间等条件做了优化，为其他动物卵巢组织的处理及2 -DE 提供了参考。 2014年，贾建磊等[12]通过研究不同电导率的水对绵羊卵巢蛋白提取及双向电泳的影响发现，超纯水做溶剂效果最好，去离子水次之，蒸馏水和自来水不适合做溶剂进行绵羊卵巢蛋白质组研究。 2015年，孟永海等[13]以大鼠肌肉组织为试验材料，比较了三氯乙酸(TCA )/丙酮沉淀法、改良的TCA/丙酮沉淀法和试剂盒法对其组织蛋白提取效果，发现常规的TCA 丙酮沉淀法提取的蛋白条带模糊，其他两种方法的提取的蛋白条带很清晰，蛋白没有降解，无拖尾现象，建立并优化了组织蛋白提取方法。

本试验利用超声破碎方法对多浪羊发情期、发情间期和妊娠期卵巢进行蛋白提取，通过质量检测比较多浪羊不同生理时期卵巢蛋白提取效果，发现3 个时期6 个样品总蛋白在25 ～200 kDa 分子量范围内得到有效分离，而且蛋白条带清晰、完整，蛋白无降解。 其中60 kDa 左右LLY-4 和LLY-5 与其他四例样本在该位置的蛋白条带丰度有些微差异，但差异不显著。 根据判定标准：蛋白条带清晰、完整、均一，蛋白无降解，蛋白总量≥400 μg，质检合格，均为A 类，可以满足后续iTRAQ 试验进行蛋白组学的研究。 该方法的试验条件相对较低，操作简单，不需要很多的仪器设备，相对其他方法比较便宜，广泛性高，更适合于动物组织蛋白的大量提取，为相关的组织蛋白的提取方法提供实验依据

综上所述，本研究采用超声破碎法提取纯化了多浪羊不同生理时间卵巢全蛋白，质量合格，满足后续蛋白组学研究，对多浪羊重要繁殖调控细胞或组织内的蛋白质组成、表达水平，以及蛋白质间相互作用关系等进行系统的分析，揭示蛋白质与多浪羊繁殖调控活动的内在联系和规律，为研究多浪羊常年发情的繁殖机理提供基础。