加米霉素注射液无菌检查方法的试验

赵梅仙， 宋 敏， 张国栋， 张传良， 徐金雷， 葛辛玫， 马佳颖， 王 楠

(中牧实业股份有限公司， 北京 海淀 100095)

加米霉素为氮杂内酯类的第二代大环内酯类抗生素，由梅里亚有限公司开发的兽用抗生素加米霉素注射液ZACTRAN，分别于2007 年、2010 年、2011 年，经由欧盟、加拿大和FDA 批准使用，对溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、睡眠嗜组织菌等病原体有很好的抑菌和杀菌作用，临床可用于预防和治疗由以上病原菌引起的牛呼吸道感染的疾病(BRD)[1-6]。 可以用于动物，具有吸收快、体内残留低、体内分部广、安全高效等优点，暂无不良反应报道。 为了保证药品的质量和用药安全，必须进行无菌控制。 本文根据《中国兽药典》2015 年版一部附录[7]、检验操作规程[8]、相关文献[9-12]对加米霉素注射液的无菌检查进行了实验研究，建立了可靠的无菌检查方法并进行了验证。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 供试品 加米霉素注射液为中牧实业股份有限公司自制(批号：130307、130319、130403)，规格为100 mL。

1.1.2 试剂 聚山梨酯80，购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨，购自北京雅客生物科技有限公司。

1.1.3 培养基 胰酪大豆胨培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基，均购自北京雅客生物科技有限公司。

1.1.4 稀释剂与冲洗液 0.1% 无菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液为自配，灭菌后备用。

1.1.5 菌种 大肠埃希菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、生孢梭菌CMCC(B)64941、白色念珠菌CMCC(F)98 001、黑曲霉CMCC(F)98003，均购自中国兽医药品监察所。

1.2 仪器 HTY-2000A 集菌仪、全封闭无菌试验过滤培养器(杭州高得泰林生物设备有限公司)。

2 方法

2.1 菌液制备

(1)取经35 ℃培养18 ～24 h 的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的胰酪大豆胨培养基1 mL，以0.9%无菌氯化钠溶液10 倍稀释至10-6～10-9约为10 ～100 CFU/mL 备用。

(2)取经35 ℃培养18 ～24 h 的生孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培养基1 mL，以0.9%无菌氯化钠溶液10 倍梯度稀释至10-7备用。

(3)取经25 ℃培养24 h 的白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂培养基，以0.9%无菌氯化钠溶液10 倍梯度稀释至10-5～10-7约为10 ～100 CFU/mL 备用。

(4)接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，取经25 ℃培养7 d 的黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加3 ～5 mL 含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱孢子，以0.05%(mL/mL)聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液10 倍梯度稀释至10-5～10-7孢子数约为10 ～100 CFU/mL 的孢子悬液做活菌计数备用。

2.2 菌液计数 取上述菌液，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌液各1 mL加入培养皿，每种菌液做2 个平皿，注入胰酪大豆胨培养基35 ℃培养24 ～48 h；生孢梭菌1 mL 加入培养皿，菌液做2 个平皿，注入硫乙醇酸盐流体培养基35 ℃培养24 ～48 h；取黑曲霉菌和白色念珠菌液各1 mL 加入培养皿，每种菌液做2 个平皿，注入沙氏葡萄糖液体培养基25 ℃培养48 ～72 h。 计数，取平均值。

2.3 培养基的灵敏度和无菌检查

2.3.1 培养基的无菌检查 取121 ℃、灭菌15 min的硫乙醇酸盐流体培养基(12 mL/管)5 支，35 ℃恒温培养14 d，取121 ℃、灭菌15 min 的胰酪大豆胨培养基(9 mL/管)5 支，25 ℃恒温培养14 d。 试验结果为无菌生长，表明培养基无菌性检查合格。

2.3.2 培养基灵敏度检查 取121 ℃、灭菌15 min的硫乙醇酸盐流体培养基(12 mL/管)7 支，分别接种小于100 CFU 的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2 支，另一支不接种作为空白对照，35 ℃恒温培养3 d；取121 ℃、灭菌15 min的胰酪大豆胨培养基(9 mL/管)7 支，分别接种枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉各2 支，另一支不接种作为空白对照，25 ℃恒温培养5 d。

2.4 方法适用性试验

2.4.1 冲洗量的确定 取本品适量，每10 mL 供试品加0.1%无菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 进行稀释，通过孔径为0.45 μm 已被冲洗剂湿润过的一次性全封闭集菌过滤培养器，分别用冲洗液300、500、700 mL 依次振摇冲洗，即每次100 mL，分别冲洗3 次、5 次、7 次，最后1 次冲洗液中加入相应的试验菌，同法过滤，再加入相应的培养基100 mL，作为供试品管。 另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为菌液对照管。

另取1 次性全封闭集菌过滤培养器过滤0.1%无菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液后，分别只加入100 mL 硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨培养基，不加对照菌液，作为该次试验的阴性对照管。置相应温度培养3 ～5 d。

2.4.2 检查方法验证 取本品适量，每10 mL 供试品加0.1%无菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 进行稀释，通过孔径为0.45 μm 的已被冲洗剂湿润过1 次性全封闭集菌培养器用冲洗液500 mL，分次振摇冲洗(每次100 mL)， 在最后1 次冲洗液中加入试验菌，过滤。 加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨培养基100 mL，作为供试品管。 另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为阳性对照。 取试验用薄膜过滤器，一滤筒加入硫乙醇酸盐流体培养基100 mL，另一滤筒加入胰酪大豆胨培养基100 mL，分别作为相应的阴性对照。 分别置于30 ℃～35 ℃、20 ℃～25 ℃培养箱中培养3 d。逐日观察结果。

2.5 供试品无菌检查 取本品10 瓶，每瓶取10 mL，每10 mL 供试品加0.1%无菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 进行稀释，采用验证过的无菌检查方法对3 批加米霉素注射液进行无菌检查，采用金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌，取试验用薄膜过滤器，一滤筒加入硫乙醇酸盐流体培养基100 mL，另一滤筒加入胰酪大豆胨培养基100 mL，分别作为相应的阴性对照，细菌培养30 ℃～35 ℃培养14 d，霉菌培养20 ℃～25 ℃培养14 d。

3 结果与分析

3.1 菌液计数 7 种菌液菌落的计数结果见表1。由表1 可知，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌液稀释到一定的浓度，菌落计数能达10 ～100 CFU/mL，符合要求，能作为试验菌液。

表1 各验证用菌液的稀释度及菌落数

3.2 培养基灵敏度检查 培养基灵敏度检查见表2， 由表2 可知，各试验菌株在硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨培养基中，经过特定的时间培养均生长良好，空白对照管无菌生长，表明该培养基对各试验菌株的生长没有影响，其灵敏度符合要求。

3.3 冲洗量的确定 逐日观察结果，结果见表3。从表3 中可知，当冲洗量为300 mL 时，除加入金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的供试品管外，其余5 种菌在规定的条件下，供试品管与菌液对照管比较，均生长良好，说明该检验量的供试品在该检验条件下对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抑菌作用，需要增加冲洗液的用量，去除抑菌成分。

表2 培养基灵敏度检查试验结果

表3 冲洗量验证试验结果

当冲洗量增加至500 mL 时，供试品管中各菌生长良好。 两个阴性对照管均无微生物生长，两种培养基均澄清透明。 因此确定本品的最佳冲洗量细菌检查和真菌检查均为500 mL。

3.4 检查方法验证结果 无菌检查方法验证结果见表4，由表4 可知，供试品各容器中试验菌均生长良好，证明了供试品的该检验量在该试验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。

表4 检查方法验证结果

3.5 供试品无菌检查 供试品的无菌检查选择金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌进行检验，其检验结果见表5。 从表5 可见，阳性对照菌72 h 内生长正常，阴性对照管、各供试品管无菌生长。

表5 供试品无菌检查结果

4 讨论

按《中国兽药典》规定的无菌检查法对加米霉素注射液进行了无菌方法研究，试验选用薄膜过滤法，选择金黄色葡萄球菌作阳性对照菌。 研究结果表明，加米霉素注射液在试验菌液计数及所用培养基无菌性、灵敏度符合规定条件下，经冲洗量为500 mL后，该产品无抑菌和干扰作用。 三批样品经检查，符合无菌要求。 因此，确定加米霉素注射液的无菌检查方法为：取本品10 瓶，每瓶取10 mL，每10 mL 供试品加0.1%无菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 进行稀释，经薄膜过滤法处理，用0.1%无菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液分次冲洗(每膜不少于500 mL)，依法检查，应符合规定。通过上述验证所建立的方法可用于加米霉素注射液的无菌检查，结果准确、可靠，同时，本试验建立的无菌检查方法对于同类注射液的无菌检查有一定的指导意义。