软皮热敷散中芳香水的提取工艺研究*

任 慧，李佰成，张 红

陕西省中医药研究院(西安 710003)

硬皮病(Scleroderma，Scl)是一种以皮肤、血管和内脏器官的纤维化，体内产生大量破坏各种细胞成分的自身抗体为特征的结缔组织病，发病有3个基本过程，即纤维化、炎症和血管功能障碍[1-2]。中医没有硬皮病这一名称，也没有确切的中医病名与之相对应。根据皮肤增厚变硬、手指肿胀僵直、肢体关节疼痛等临床表现，将硬皮病归于“痹证”范畴[3]。其病因及发病机制复杂，涉及血管异常、免疫异常及胶原异常等，近年来研究表明转化生长因子β(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)等多种细胞因子可能在硬皮病纤维化的过程中发挥着重要作用，目前该疾病尚无特效治疗方法[4]。扶正祛邪是硬皮病的根本治则，扶正以益气养血、温补脾肾为主，祛邪以祛风散寒除湿、活血化痰通络为主，亦可归纳为“补”、“通”二字[3]。软皮热敷散是陕西省中医医院皮肤科用于治疗硬皮病的经验处方，疗效卓著。该方由艾叶、桂枝、陈皮、山豆根、威灵仙、刘寄奴、红花等中药组成，具有活血通络、散寒祛湿之功，用于皮痹、冻疮、雷诺氏病、蛇串疮后遗神经痛等病。由于该药使用前需用布包上笼屉加热30min后热敷，操作繁复，为了方便推广使用，考虑将其改为软膏剂[5-6]。因而，需要对该处方药材的提取工艺及制剂的制备工艺进行研究。一般对药材采取水提、醇提工艺研究较多，而对处方中的药材挥发性成分提取率很低，往往药材中挥发性成分是处方中一大类具有生物活性的物质。该处方中艾叶的主要活性物质为挥发油、黄酮类、鞣质类、三萜类、桉叶烷类、多糖类及微量元素等成分，其挥发油中含量较高的成分为桉树脑、石竹烯、石竹烯氧化物、3-金钟柏酮、龙脑、4-香芹孟烯醇、刺柏脑、反-p-2,8-二烯薄荷醇等[7]。桂枝的化学物质主要有挥发油类、有机酸类、多糖类、香豆素类及鞣质类成分，其挥发油中主要含有桂皮醛、桂皮醇、甲氧基桂皮醛、苯甲醛、3-羟基苯甲醛、2-丙烯-1-醇-3-苯基乙酸酯、茨烯、桉叶素-对伞花烃、萜烯-4-醇、α-胡椒烯、β-榄香烯、白菖蒲烯等[8]。陈皮中主要活性物质为挥发油、黄酮类、有机胺类及微量元素等成分，其挥发油约占2%～4%，主要含有D-柠檬烯、γ-松油烯、β-月桂烯、α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇、柠檬醛、α-萜品醇等[9]。可见，处方中艾叶、桂枝、陈皮等为富含挥发性成分的药材，然而挥发性成分的含量一般较低，难以提取到挥发油，因而实验室考虑采用水蒸气蒸馏法提取芳香水[10-11]。为了优化软皮热敷散中芳香水的提取工艺，借助芳香水在紫外波长下有吸收峰的特点，采用紫外分光光度法及薄层层析法对芳香水的提取工艺进行研究；剩余残渣则以橙皮苷的含量及干膏得率为评价指标优选水提条件[12]。

仪器与试药

1 仪 器 日本岛津生产的2010A-UV型高效液相色谱仪，日本日立高新技术公司生产的U-2910型紫外分光光度计，西安武本生物科技有限公司的Woburn LP-C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)，挥发油提取器，北京市永光明医疗仪器厂生产的101型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司的HSY-2MB电热恒温水浴锅，慈溪红钻衡器设备有限公司生产的HZ2001A称量天平，北京赛多利斯天平有限公司生产的BT25S型和BS210S型电子分析天平。

2 试 药 处方中所用艾叶、桂枝、陈皮等药材均由陕西省中医医院提供；橙皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：110721-200613)；色谱纯甲醇(美国FISHER公司)，纯化水，石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、醋酸、浓硫酸、二硝基苯肼均为分析纯，硅胶G(青岛海洋化工)。

方法与结果

1 芳香水的提取工艺

1.1 芳香水的提取

1.1.1 吸水率的测定：按照处方比例称取艾叶、桂枝、陈皮等药材共计52.5 g，加水400 ml，浸泡过夜[13]，过滤，计算药材吸水率为202 %。

1.1.2 挥发油的提取：按照处方比例称取艾叶、桂枝、陈皮等药材共计52.5 g，加入10倍量的水，浸泡45 min[14]，且补足吸水率，水蒸气蒸馏，并适当控制蒸馏速度，蒸馏提取6 h，得到挥发油量约0.15 ml，提取率较低。

1.1.3 芳香水提取：按照处方比例称取艾叶、桂枝、陈皮等药材共计52.5 g，加20倍量的水，浸泡45 min，水蒸气蒸馏，适当控制蒸馏速度，分别于0.5、1、2、3、4、5、6 h收集芳香水，共7份，备用。

1.2 薄层层析：用毛细管分别吸取0.5、1、2、3、4、5、6 h处收集的芳香水各5 μl，并分别点于同一硅胶G薄层板，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(17：3)为展开剂，展开，取出，然后用冷风吹干，喷以二硝基苯肼试液显色，日光下观察，可以看见清晰的斑点，直观分析挥发油的提取程度(图1)[15]。

由图1可看出，水蒸气蒸馏法提取4 h以后，薄层斑点已不是很明显，说明挥发性成分已基本提尽，故初步确定芳香水的提取时间为4 h[10]。

1.3 吸光度的测定

1.3.1 检测波长的确定:精密吸取收集的第一份芳香水2 ml，置于10 ml容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度定容，借助紫外可见分光光度计在200 nm～400 nm波长范围内扫描，根据扫描结果显示的芳香水最大吸收波长，选定在351 nm处检测。

1.3.2 吸光度的测定:精密吸取各时间段内收集的软皮热敷散芳香水2 ml，置10 ml容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度定容后，并于351 nm处测定吸光度值，结果见表1(图2)。

表1 芳香水收集表

注：∑Ai=收集量×吸光度A,百分比%=∑Ai/∑A总(∑A总=∑A1+∑A2+……+∑A7)

图1 芳香水的薄层层折图2 芳香水收集

由表1和图2可以看出软皮热敷散芳香水收集时间达4h时，已累计得到95.30%，表明软皮热敷散中挥发性成分已经基本提取完全，因此确定软皮热敷散芳香水的提取时间以4 h为宜[10]。

由表1可知，软皮热敷散采用水蒸气蒸馏4 h内收集到508 ml芳香水，约为提取药材量的9.7倍，可以明显看出软皮热敷散芳香水收集量过多，因此需要进行二次蒸馏[16]，采用上述方法测定，结果见表2(图3)。由结果可判断二次蒸馏以3 h为宜。

表2 芳香水二次蒸馏收集表

2 残渣的提取工艺 称取艾叶、桂枝、陈皮等药材，共三份，分别加20倍量的水，收集4 h内的芳香水，过滤，保留滤液，剩余残渣加10倍量的水回流提取，分别提取1、1.5、2h，合并滤液，备用，考察残渣的最佳水提时间。

2.1 橙皮苷的测定

2.1.1 色谱条件[12，17]为流动相：甲醇-醋酸-水(35：4：61)；检测波长为283 nm；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；进样量为10 μl。

2.1.2 橙皮苷对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品，精密称定，加甲醇定容，制成200 μg/ml的橙皮苷溶液，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备：精密吸取水提液1 ml，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备：按照处方比例称取软皮热敷散药材(去除陈皮)[18]，并按照软皮热敷散提取工艺制备提取液，再精密吸取本品溶液1 ml，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.1.5 供试品溶液的测定：供试品色谱图与橙皮苷对照品色谱图在相同时间处有色谱峰，阴性对照溶液色谱图与橙皮苷对照品色谱图相比在相同时间处无吸收峰，表明软皮热敷散中其它药材对橙皮苷的测定无干扰[19]。在该条件下测定不同提取时间的水提液中橙皮苷含量分别为278.95、273.18、278.67 mg。

2.2 干膏得率的测定：用移液管精密量取提取液50 ml，分别转移至已经恒重的蒸发皿中，放置在水浴锅上蒸干，再将其置于105℃烘箱中干燥3h[13]，取出后放置在干燥器中冷却30min至室温，迅速称定重量，计算干膏得率分别为20.69 %、20.82 %、21.00 %。

综上所述，采用不同时间得到的软皮热敷散提取液中橙皮苷的含量和干膏得率差异不是很大，从节约成本和实际需要等因素综合考虑，剩余残渣采用10倍量的水加热回流提取1h为宜。

3 验证试验 称取艾叶、桂枝、陈皮等药材，共三份，分别加20倍量的水，浸泡45min，收集芳香水4h，过滤，残渣加10倍量水提取1h，合并滤液。经薄层层析(图4)可见提取4h内芳香水斑点清晰，且残渣的橙皮苷提取率和干膏得率重复性好，见表3。

图3 芳香水二次蒸馏的薄层层折 图4 芳香水的薄层层折

编 号药材量(g)橙皮苷含量(mg)干膏得率(%)1号52．5279．5420．872号52．5264．9520．823号52．5275．1821．41平均值52．5273．2321．03RSD(%)2．741．56

讨 论

软皮热敷散是陕西省中医医院皮肤科用于治疗硬皮病的经验处方，疗效卓著。处方中艾叶味辛、苦，性温，具有温经止血，散寒止痛，除湿杀虫之功；桂枝味辛、甘，性温，具有散寒解表、温通经脉、通阳化气之功；陈皮味苦、辛，性温，具有理气健脾、燥湿化痰之功效；山豆根味苦，性寒，能清热解毒；威灵仙味辛、咸，性温，能祛风湿、通经络；刘寄奴味苦，性寒，具有活血祛瘀、通经止痛、凉血、清热利湿之功效；红花味辛，性温，能活血通经，祛瘀止痛。由于该药使用操作繁复，不便于推广使用，考虑将其改为软膏剂。中药挥发油是一大类重要的有效成分，具有较强的药理作用，其透皮吸收促进作用强[20]。因此，对软皮热敷散中富含挥发性成分的药材的提取工艺进行研究是非常有必要的。采用水蒸气蒸馏的方法提取软皮热敷散中的挥发油，观察到蒸馏6h得到挥发油量约0.15 ml，得率较低，其原因可能为软皮热敷散药材中挥发性物质总量较少，在蒸馏过程易被乳化或溶解[21]。同时观察到软皮热敷散提取到的芳香水气味浓郁，但是芳香水中的挥发性成分与水很难分离，实验过程中尝试加入食盐、冷藏的办法也没有分层，因此考虑改为以芳香水加入制剂。水蒸气蒸馏法提取芳香水，能较好地保留挥发性有效组分，工艺操作简便，价格低廉[21]。另外，该方法不使用有机溶剂，省去了除去有害杂质的过程，绿色环保。

本研究确定的水蒸气蒸馏法提取软皮热敷散富含挥发性物质药材的最佳提取条件为加20倍量水，浸泡45 min，蒸馏提取4 h，合并收集芳香水；提取液过滤，残渣加10倍量水，提取1 h，合并提取液。该方法科学、合理、稳定、可行，可为生产开发提供参考。

[1] 巫婷婷，周京国. 硬皮病动物模型及其应用研究进展[J]. 动物医学进展，2008，29(2)：102-105.

[2] Abraham D J,Varga J. Scleroderma：from cell and molecular mechanisms to disease models[J]. Trends Immunol，2005，26(11)：587-595.

[3] 梁 辉. 中医治疗硬皮病研究进展[J]. 社区医学杂志，2012，10(21)：19-20.

[4] 赵 云，李建勤，黄长征. 细胞因子与硬皮病研究进展[J]. 中国中西医结合皮肤性病学杂志，2017，16(2)：171-173.

[5] 林俊华，蔡 翔，苏明武，等. 防茄软膏的制备工艺研究[J]. 首都医药，2014，11(14)：86-88.

[6] 夏 晨，谈 戈. 浅谈我院中药软膏剂的制备工艺与质量控制[J]. 北方药学，2016，13(3)：112-113.

[7] 王惠君，王文泉，卢 城，等. 艾叶研究进展概述[J]. 江苏农业科学，2015，43(8)：15-19，44.

[8] 许 源，宿树兰，王团结，等. 桂枝的化学成分与药理活性研究进展[J]. 中药材，2013，36(4)：674-678.

[9] 李晓芳，张健康，王慧鸾，等. 陈皮的研究进展[J]. 江西中医药，2014，45(37)：76-78.

[10] 张海先，李 琼，曾 锐. 清目口服液中菊花芳香水提取工艺研究[J]. 西南民族大学学报:自然科学版，2013，39(3)：330-332.

[11] 蒲志强，周 立，盛 蓉，等. 鼻炎通窍喷雾剂的提取工艺研究[J]. 中成药，2011，33(9)：1604-1607.

[12] 董 村，赵 宇. 高效液相色谱法测定桑椹枸杞酒中橙皮苷的含量[J]. 中华中医药杂志，2016，31(7)：2800-2802.

[13] 刘军锋，华 瑛，王红波，等. 痰饮膏剂型改进的工艺研究[J]. 陕西中医，2014，35(7)：914-916.

[14] 赵海峰，郑 洁，张 萌，等. 芳香性中药煎药方法研究[J]. 陕西中医，2013，34(1)：84-86.

[15] 何 姣，张雅惠，孙文基. 肉桂、桂枝薄层鉴别方法之改进初探[J]. 中国药品标准，2008，9(1)：34-35.

[16] 王志超. 双花喷雾剂制备工艺研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2003，9(4)：21，25.

[17] 项 菲，肖 燕. 高效液相色谱法测定小儿止咳糖浆橙皮苷的含量[J]. 中国民族民间医药，2008，17(7)：31-32.

[18] 孙丽娜，刘小虹，刘建博，等. 复方五指毛桃颗粒的提取工艺研究[J]. 中国药房，2017，28(28)：3976-3979.

[19] 徐文杰，周 蓉，王洛临，等. 活血化瘀颗粒提取工艺优选[J]. 中药材，2014，37(9)：1667-1672.

[20] 陈 军，刘 培，蒋秋冬，等. 中药挥发油作为透皮吸收促进剂的现状与展望[J]. 中草药，2014，45(24)：3651-3655.

[21] 刘 智，郭艳波. 金银花芳香水提取研究[J]. 黑龙江医药，2012，25(2)：241-242.