大蒜素对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的预防作用

吴曼曼，王佳，李娜，赵鑫，李新莉

大连医科大学 生物技术系，辽宁 大连 116044

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是酒精摄入过量(急性)或长期酗酒(慢性)导致的中毒性肝损伤，初期常诱发脂肪肝，进而发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，最终导致肝功能衰竭[1]。由于肠—肝轴的存在，通过胆汁的分泌和肝脏血流的变化，肠道菌群的结构与组成常常发生改变。酒精性肝损伤存在着肠道屏障的损害和肠道菌群的失衡，主要表现为侵入性细菌数量增加，保护性细菌数量减少，这种变化在某种程度上影响肝损伤的进程。Kirpich等[2]发现酒精性肝脏损伤患者肠道菌群结构改变，双歧杆菌、乳杆菌数量明显减少，短期补充双歧杆菌后肝脏转氨酶、乳酸脱氢酶活力和总胆红素含量降低；蔡夏夏等[3]研究表明酒精性肝损伤动物肠道菌群改变，出现肝脏脂肪变性及肠道上皮细胞屏障功能障碍等，通过补充天然活性成分能够刺激双歧杆菌等益生菌的生长，具有益生元的作用。大蒜素(allicin)是从葱科植物大蒜中提取的具有生物活性的含硫化合物总称，有特殊气味，具有较好抗菌、调血脂、降血糖、抗肿瘤、抗衰老等功能[4]。大蒜素对酒精性肝损伤具有保护作用，其机制与清除自由基，抑制脂质过氧化产物对膜结构的损害有关[5]。本课题利用大蒜素对小鼠预防给药30 d，使用56度红星二锅头灌胃小鼠建立急性酒精性肝损伤模型，ERIC-PCR和PCR-DGGE技术研究大蒜素对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的预防作用，分析肠道菌群结构的整体差异并鉴定优势条带序列。以肠道菌群作为治疗酒精性肝病的潜在作用靶点，初步探讨大蒜素预防酒精性肝损伤的可能作用机制，为进一步开发保肝护肝药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 大蒜素(自制，产率7.27%，含量0.978%)；护肝片(长春海外制药集团有限公司，批号：Z22020994，规格：0.35 g)；北京56度红星二锅头(北京红星股份有限公司)；粪便细菌DNA提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司)；GC-341f(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGC-GGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCA-G)，518r(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG)，ERIC-1(A-TGTAAGCTCCTGGGGATTCAC)，ERIC-2(AA-GTAAGTGACTGGGGTGAGCG)(英潍捷基上海贸易有限公司)；PCR-Mix(大连优萌威贸易有限公司)，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、去离子甲酰胺、琼脂糖、溴化乙锭(EB)(大连羽铭生物科技有限公司)；DL2000 Marker，DL100 Marker(大连宝生物工程有限公司)。

1.2仪器 UVS-1涡旋振荡器(北京优晟科技有限公司)，HC-3018R高速冷冻离心机(离心半径6 cm)(安徽中科中佳科学有限公司)，JY-spat琼脂糖水平电泳仪、DGGE电泳仪(大连竞迈设备有限公司)。

1.3动物 SPF级KM小鼠，雌、雄各半，体重18～22 g，由大连医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(辽)2008-0002。

1.4方法

1.4.1分组与处理 护肝片和大蒜素分别溶于生理盐水配成护肝片溶液(6 mg/mL)、大蒜素高浓度(200 mg/mL)和低浓度(50 mg/mL)溶液[6]。小鼠随机分为正常对照组(N)、急性酒精性肝损伤组(A)、护肝片组(P)、大蒜素高(GH)、低浓度组(GL)，每组8只。除N组和A组，其他组灌服相应药物0.2 mL 30 d，末次给药30 min后，正常对照组灌服生理盐水，其他组灌胃14 mL/kg红星二锅头建立急性酒精性肝损伤模型，12 h后取每只小鼠粪便，于-80℃保存。

1.4.2粪便细菌DNA提取 使用试剂盒提取每只小鼠粪便细菌DNA，按说明书进行操作。

1.4.3PCR扩增 使用ERIC-PCR上、下游引物ERIC-1和ERIC-2，扩增体系(25 μL)为：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，去离子水补充至25 μL。PCR程序：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 50 s，退火49℃ 30 s，46℃ 30 s，延伸72℃ 3 min，35个循环；充分延伸72℃ 9 min。PCR扩增产品用3%琼脂糖凝胶电泳检测，以2 000 bp Marker为参照。

1.4.4PCR-DGGE电泳 使用16S rRNA基因V3可变区上、下游引物GC-341f和518r，扩增体系同1.4.3。PCR程序：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30个循环；充分延伸72℃ 7 min。采用8%丙烯酰胺凝胶配制25%～50% DGGE变性梯度凝胶[其中100%浓度变性梯度凝胶含40%(v/v)去离子甲酰胺和7 mol/L尿素]，取10 μL PCR产物于DGGE胶，60℃、70 V电泳5 h，电泳后取出凝胶使用0.125‰ EB染色，拍照。

1.4.5差别条带序列分析 切下DGGE图谱中的优势条带，加入20 μL无菌水捣碎，于95℃浸泡10 min，37℃过夜，取上清液作模板进行PCR扩增，引物为341f和518r，PCR反应体系和程序同1.4.4。PCR产物经测序，结果在GenBank数据库中进行Blast对比分析。

1.5统计学处理 用Quantity One 4.6.2软件对DGGE图谱进行UPGMA聚类分析，用Matlab V7.0软件对ERIC-PCR图谱进行主成分PCA分析。

2 结 果

2.1EIRC-PCR图谱分析 大蒜素对小鼠进行预防给药30 d后建立急性酒精性肝损伤模型，肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱如图1a所示。正常对照组(N1和N2)条带较多，以小片段居多，两条主要条带集中在300 bp和500 bp附近，以300 bp左右的条带强度最强。急性酒精性肝损伤模型组条带数量减少，除大蒜素高剂量组(GH1和GH2)外，其他实验组均以300 bp左右的条带为优势条带，而500 bp左右的条带强度减弱。使用高浓度大蒜素对小鼠进行预防给药，小鼠肠道中条带数量基本不变，但是300 bp左右的条带强度明显减弱，500 bp左右的条带强度有增加的趋势。以上研究结果表明酒精建立急性肝损伤模型小鼠肠道菌群结构发生改变，300 bp和500 bp左右的条带为急性酒精性肝损伤组和大蒜素预防给药组小鼠肠道中的特征条带。PCA分析(图1b)结果显示，A1、P1、GH2、GL1和GL2组分布于同一区域，距离较近，与正常组沿PC2方向显著分开，这也表明急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群结构与正常组相比具有显著差异。A1和A2组与其他实验组沿PC1方向显著分开，距离较远，这表明急性酒精性肝损伤小鼠与使用护肝片和大蒜素预防组小鼠肠道菌群结构有差异。

2.2PCR-DGGE图谱分析 大蒜素对小鼠预防给药30 d后使用红星二锅头建立酒精性肝损伤小鼠模型，肠道菌群DGGE图谱如图2a所示。同一位置的条带代表相同的优势细菌，条带亮度则反映出这一细菌的相对含量。N1、N2泳道条带较多，且亮度较强，表明正常组小鼠肠道菌群的数量和含量均较高。而其他实验组条带数量有所减少，表明酒精导致的急性肝损伤小鼠肠道菌群的丰富度和多样性减低。条带a、b、c、d基本存在于各组样品中为共有条带，说明其所代表的细菌是小鼠肠道中的优势菌群，其中条带a所代表的细菌在大蒜素高剂量组中含量最大。条带g在N泳道中强度高，含量大，而在其他实验组中含量明显降低，这表明酒精导致急性肝损伤，小鼠肠道菌群种类发生改变，条带g所代表的细菌是差异菌群。条带e和f存在于泳道N1、N2和A1、A2中，而在护肝片和大蒜素长期干预组中含量很低，几乎消失，这表明e和f所代表的细菌是长期服用护肝片或大蒜素的小鼠与对照组小鼠肠道差异菌群。UPGMA分析DGGE图的相似性，结果显示各组小鼠肠道菌群结构聚成两大簇，急性酒精性肝损伤对照组聚成一簇，其他组聚成另一簇，两大簇之间相似性较低，仅为0.54，表明酒精导致的急性肝损伤，对小鼠肠道菌群结构存在显著影响。大蒜素高剂量组(GH1和GH2)与其他实验组之前的相似性仅有0.57，表明长期灌服大蒜素对小鼠肠道菌群结构也有一定影响。

N：正常组，A：急性酒精性肝损伤组，P：护肝片组，GL：大蒜素低浓度组，GH：大蒜素高浓度组

图1大蒜素对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群ERIC-PCR图谱(a)和PCA主成分分析结果(b)

N：正常组，A：急性酒精性肝损伤组，P：护肝片组，GL：大蒜素低浓度组，GH：大蒜素高浓度组

2.3差异条带序列分析 DGGE图谱优势条带测序结果在GenBank中用Blast进行检索和同源性比较，如表1所示。粪便细菌与数据库已知细菌序列的相似性均在93%以上。

表1 DGGE图谱中优势条带测序与参比序列对照结果

由表1可知，菌a和g分别与砂优杆菌和Eubacteriumplexicaudatum的相似性为96%和94%，两者均为优杆菌属(Eubacterium)。菌b与维氏气单胞菌的相似性为93%，菌c与Lactobacillusequicursoris的相似性为96%，菌d与牙龈卟啉单胞菌的相似性为100%，菌e与Enterococcussulfureus的相似性为97%，菌f与梭菌属的相似性为97%。建立急性酒精性肝损伤模型小鼠肠道菌群失调，粪便标本中优杆菌属细菌明显减少，Enterococcussulfureus等肠球菌和梭菌为正常小鼠肠道优势菌型，护肝片或大蒜素预防给药30 d，以上2种细菌含量明显减少。

3 讨 论

3.1结果分析 ERIC-PCR图谱和PCA分析表明正常小鼠肠道中菌群条带较多，主要集中在300 bp和500 bp附近。除大蒜素高剂量预防给药组外，其他急性酒精性肝损伤小鼠肠道中以300 bp左右的条带为优势条带，而500 bp左右的条带强度减弱。大蒜素高剂量组小鼠肠道中300 bp左右的条带强度较弱，500 bp左右的条带强度有增加的趋势。因此，推测300 bp和500 bp左右的条带为急性酒精性肝损伤组和大蒜素干预组小鼠肠道中的特征条带，可作为后续筛选酒精性肝损伤药物的切入点。ERIC-PCR技术可以快速、灵敏地从分子水平比较分析微生物群落的结构，从而实现对调节肠道菌群药物的筛选，可是因为其通过DNA分子量来分离目标条带，可能相同条带包括多种细菌，ERIC-PCR只能简单判断样品中微生物的分布趋势。为明确肠道菌群优势条带的序列及菌群结构的整体差异，基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技术被应用于研究大蒜素对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的预防作用，为开发利用大蒜素的生物活性提供一个新方向。实验结果表明大蒜素预防给药能够增加肠道中优杆菌属细菌的数量，抑制肠球菌的生长。据文献报道[7]，优杆菌是人和动物口腔与肠道正常菌群的成员，对机体有营养生物拮抗和维持肠道微生物生态学平衡等功能。而肠球菌是引起感染的重要病原菌[8]，对多种抗生素具有耐药性。故大蒜素对肠道菌群结构具有很好的保护作用。

3.2研究意义 肝脏是人体最大的器官，具有双重血液供应系统，与肠道之间存在密切的联系，形成肠—肝轴。在肝损伤的发生发展中，肠道菌群发挥着重要作用，肠道与肝损伤之间相互促进相互影响的关系也被逐渐阐明[9]。人体肠道细菌以厌氧菌为主，传统的微生物技术如培养计数技术，仅能反映肠道菌群数目变化这一指标，更有超过70%的肠道菌群无法通过传统的细菌培养方法进行培养和鉴定，不能反映肠道菌群结构的多样性和种群变化，因此，ERIC-PCR、PCR-DGGE等分子生物学方法被广泛用于菌群结构及种群变化，具有灵敏度高、可重复性、可靠性好，省时省力等优点。本研究利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技术分析大蒜素对酒精性肝损伤小鼠肠道菌群的影响，发现急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群组成结构发生改变，大蒜素预防给药能够增加小鼠肠道中益生菌数量，抑制致病菌生长，为大蒜素预防酒精性肝损伤伴有肠道菌群失调提供实验依据，为深入研究肠道菌群在酒精性肝损伤发生发展中的作用奠定基础，以肠道菌群作为筛选治疗酒精性肝病药物的新靶点。

3.3同类研究的比较 天然产物具有益生元样作用，且药物资源丰富、疗效独特、毒副作用小，具有“已病治病，未病防病，无病强身”的特点。例如茵陈合剂可以调节肝细胞生长因子，促进肝细胞的再生，改善肝功能，恢复肠道微生态平衡[10]；藏方甲嘎松汤能够降低急性肝损伤小鼠肝脏IL-6、IFN-γ、TGF-β1水平，增加肠道中双歧杆菌数量，对急性肝损伤小鼠具有保肝作用[11]。总之，天然产品在防治急性酒精性肝损伤及其伴有的肠道菌群失调方面体现出许多优势，其开发潜能引起人们的关注。

3.4研究的不足 大蒜素对急性酒精性肝损伤伴有的肠道菌群失调具有一定的预防作用，主要表现为促进优杆菌属的生长，同时对肠球菌等病原菌有抑制作用，为研究肝损伤和肠道菌群的关系和药物筛选提供新的思路与途径。ERIC-PCR和PCR-DGGE为半定量分析，在后续实验中增加Real-time PCR对小鼠肠道中的优势菌群进行定量分析，并且希望通过对小鼠肠道机械屏障、免疫屏障等的研究阐明大蒜素对肠道菌群的作用机制。

[1] Domitrovi R. The molecular basis for the pharmacological activity of anthocyans[J]. Curr Med Chem, 2011, 18(29): 4454-4469.

[2]Kirpich IA, Solovieva NV, Leikhter SN, et al. Probiotics restore bowel flora and improve liver enzymes in human alcohol-induced liver injury: A pilot study[J]. Alcohol, 2008, 42(8): 675-682.

[3]CAI Xiaxia, BAO Lei, WANG Nan, et al. Effects of dietary 5′-nucleotides on gut microbiota in rats with ethanol-induced liver injury[J]. Food Sci, 2015, 36(15): 212-216. (in Chinese)

蔡夏夏, 鲍雷, 王楠, 等. 膳食5′-核苷酸对酒精性肝损伤大鼠肠道菌群的影响[J]. 食品科学, 2015, 36(15): 212-216.

[4]YU Yang, XU Ye, LIU Shibing, et al. Effects of allicin on the capacity for learning and the expression of oxidative stress related proteins in D-galactose induced aging rats[J]. Med J Chin People′s Liberation Army, 2015, 40(11): 880-884. (in Chinese)

于洋, 徐冶, 刘师兵, 等. 大蒜素对D-半乳糖致衰老模型大鼠学习记忆能力及脑组织氧化应激相关蛋白的影响[J]. 解放军医学杂志, 2015, 40(11): 880-884.

[5]HUANG Jiean, DING Hong. The protective effect of allicin on ethanol liver damage[J]. World Chin J Digest, 1999, 7(5): 427-428. (in Chinese)

黄杰安, 丁虹. 大蒜素对乙醇性肝损伤的保护作用[J]. 世界华人消化杂志, 1999, 7(5): 427-428.

[6]JING Lijuan, ZHANG Na, YANG Wei, et al. The protective effects of allicin on gastric ulcer in rats through anti-oxidative stress and inhibition COX-2 signal pathway[J]. Pharm Clin Chin Mater Medica, 2017, 33(2): 37-41. (in Chinese)

金丽娟, 张娜, 杨伟, 等. 大蒜素通过抗氧化应激和抑制COX-2信号通路保护胃溃疡大鼠的机制研究[J]. 中药药理与临床, 2017, 33(2): 37-41.

[7]YANG Bing, FU Xueqiong, PENG Songxing, et al. Clinical study on probiotics in preventing antibiotic-associated dysbacteriosis[J]. Proc Clin Med, 2014, 23(9): 658-659. (in Chinese)

杨兵, 付雪琼, 彭颂兴, 等. 益生菌预防抗生素相关性菌群失调的临床研究[J]. 临床医药实践, 2014, 23(9): 658-659.

[8]Beshiru A, Igbinosa IH, Omeje FI, et al. Multi-antibiotic resistant and putative virulence gene signatures inEnterococcusspecies isolated from pig farms environment[J]. Microb Pathog, 2017, 104(1): 90-96.

[9]ZHENG Fengling, LUO Huanhuan. Progress in the relationship between intestinal flora and chronic liver injury[J]. Guangdong Med J, 2015, 36(14): 2269-2271. (in Chinese)

郑锋玲, 骆欢欢. 肠道菌群与慢性肝损伤关系的研究进展[J]. 广东医学, 2015, 36(14): 2269-2271.

[10] TENG Yan, JING Guijun, YANG Mei, et al. The effects of Yin Chen compound on hepatocyte factor and intestinal flora changes in patients with acute hepatic injury[J]. Chin J Microecol, 2010, 22(2): 162-163. (in Chinese)

滕岩, 景桂军, 杨梅, 等. 茵陈合剂对急性肝损伤患者肝细胞因子及肠道菌群变化的影响[J]. 中国微生态学杂志, 2010, 22(2): 162-163.

[11] LIN Xi, XIE Xiaohuang, WU Shijiao, et al. Effects of Jiagasong Soup on gut microbiota and levels of cytokines in acute hepatic injury mice[J]. Guid J Tradit Chin Med Pharm, 2016, 22(10): 10-12. (in Chinese)

林曦, 谢晓煌, 吴仕娇, 等. 甲嘎松汤对急性肝损伤小鼠肠道菌群及细胞因子的影响[J]. 中医药导报, 2016, 22(10): 10-12.