不同草莓品种无菌苗增殖及不定芽诱导的研究

张立磊，李桂荣*，张 浩，金万梅

(1.河南科技学院 园艺园林学院，河南 新乡 453003；2.北京市农林科学院 林业果树研究所，北京 100093)

草莓(Fragariaananassa)栽培面积和产量在世界浆果类水果生产中仅次于葡萄[1-2]。草莓具有适应性广，栽培容易、结果早、产量高、收益好等优点，是一种经济价值较高的高档食品，草莓主要是通过种子、分株和匍匐茎等形式繁殖[3]，但是现在引进的草莓资源多数倍性较高，遗传上高度杂合，植株分生少，不发达，用分株方法繁殖系数较低，而且通过常规育种和繁殖途径改良某些不良性状并加速繁殖受到很大限制[4-5]，生物技术的应用为草莓育种和快繁开辟了一条新的途径，如何提高草莓离体培养增殖率及在遗传转化时其再生率和再生芽数是需要不断改进的技术问题[6-7]。

影响草莓增殖及再生频率的高低因素很多，如材料因素、基本培养基、培养条件等。材料因素包括材料的基因型、生理状态等，其中材料生理状态对于诱导不定芽的发生有较大影响[8-12]。本试验在前期试验的基础上通过在离体培养下，采用4个不同草莓品种的无菌苗，经过不同时间进行继代培养，研究基因型和继代时间对增殖倍数的影响，同时对获得的无菌苗采用叶片和叶柄2个部位的材料，接种到不同培养基上进行再生分化诱导，获得了大量的不定芽，为草莓离体增殖培养及再生体系的建立提供了理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

4种草莓品种(红颜、章姬、美香莎、哈尼)无菌苗由北京市农林科学院林业果树研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 增殖培养 将4种草莓的无菌苗(株高1.5～2 cm)，接种到增殖培养基(MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA+6 g·L-1琼脂+30 g·L-1蔗糖)上，进行增殖培养，继代增殖时间分别为14、21、28 d。

1.2.2 不定芽诱导培养 采用叶片和叶柄为材料，接种在不定芽诱导培养基上30 d。叶片处理：选择无菌苗上幼嫩、平展的叶片，剪成的长、宽分别为0.3 cm，接种时所有的叶片都是背面朝下放置。叶柄处理：选择无菌苗上颜色嫩绿的基部大约1 cm长的叶柄部分，剪成长度为0.5 cm。

不定芽诱导培养基分别为：R1：MS+2.0 mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1IBA+6 g·L-1琼脂+30 g·L-1蔗糖；R2：MS+3.0 mg·L-1BA+0.1 mg·L-12.4-D+6 g·L-1琼脂+30 g·L-1蔗糖。

1.2.3 培养条件 培养基pH值均为6.0。培养条件为16 h(光)/8 h(暗)，光强2 000～3 000 lx，温度23～25℃。

1.3 观察统计

增殖培养时，每7 d观察1次，记录增殖倍数、生根数(条)、愈伤组织生长情况及叶片生长情况，增殖倍数=继代后增殖数/接种外植体总数。培养30 d后进行诱导分化培养，再生培养30 d后统计再生率、再生芽数及玻璃化率。再生率=(再生不定芽外植体总数/接种外植体总数)×100%；玻璃化率=玻璃化总数/外植体总数×100%。采用Excel2003和DPS9.50进行数据统计分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同草莓品种无菌苗的增殖生长

由表1可以看出，不同草莓品种增殖倍数不同，红颜草莓增殖倍数最高，为7.767，与其他3个品种增殖倍数差异显著(P<0.05)，哈尼草莓增殖倍数最低，仅为3.333。红颜草莓的生根数也最多，达11.1个，与其他3个品种生根数差异显著(P<0.05)，章姬草莓和美香莎草莓生根数差异不显著(P>0.05)，哈尼草莓的生根数最少，为6.767个。诱导增殖过程中，红颜和章姬不易产生愈伤组织，伸展的叶片正常，红颜叶大而平展，绿色，叶厚，而美香莎和哈尼易产生愈伤组织，叶片伸展状况不佳，美香莎叶下垂不展，浅绿，少数发黄，哈尼叶小平展，叶薄，下部发黄，说明增殖过程中愈伤组织的产生不利于根及叶片等其他器官的发育生长。

表1 不同草莓品种无菌苗的增殖生长

注：同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

另外，由表1还可以看出，4个品种随着时间的增加，增殖速率相差较大，同一时间内，红颜增殖速率较快，继代培养14 d，增殖倍数为3.870，而哈尼较低，增殖倍数仅为2.2；继代培养21 d，红颜的增殖倍数较高，为6.133，而哈尼的较低，增殖倍数仅为2.552；继代培养28 d，红颜的增殖倍数仍然最高，为7.767，哈尼的增殖倍数仅为3.333。同一品种随着增殖培养时间的增加，增殖倍数随着增加，红颜继代培养28 d的增殖倍数比14 d增殖倍数高3.967，章姬继代培养28 d的增殖倍数比14 d增殖倍数高2.333，美香莎继代培养28 d的增殖倍数比14 d增殖倍数高1.266，哈尼继代培养28 d的增殖倍数比14 d增殖倍数高1.133，同时也可以看出红颜增殖速率较快。

2.2 不同培养基诱导4个草莓品种不同部位不定芽的生长

2.2.1 不同培养基诱导4个草莓品种叶片不定芽的生长 由表2可知，4种不同品种继代材料叶片在同一培养基上诱导再生分化不同，红颜草莓再生频率最高，为74.53%，哈尼草莓的为71.33%，与红颜草莓的差异不显著(P>0.05)美香莎的再生频率最低，为54.07%，与红颜草莓的差异显著(P<0.05)，红颜草莓每叶片平均再生芽数也最多，为2.98个，与其他3种草莓的差异显著(P<0.05)，从玻璃化程度上看美香莎的最严重，为21.23%；这说明在R1培养基上，红颜草莓无菌苗的再生频率及每叶片平均再生芽数都是最好。在R2培养基上4种草莓再生频率不同，最高的是红颜草莓，再生频率为80.40%，与其他3种草莓的差异显著(P<0.05)，红颜草莓每叶片平均再生芽数也最多，为3.65个，与其他3种草莓的差异显著(P<0.05)，从玻璃化程度上看美香莎的最严重，为16.73%；这说明在R2培养基上，红颜草莓无菌苗的再生频率及每叶片平均再生芽数都是最好。

而同一品种继代材料叶片在不同培养基上诱导分化效果不同。由表2还可知，红颜草莓在R2上的再生频率为80.40%，高于R1上的再生频率(74.53%)，每叶片平均再生芽数R2上的为3.65也高于R1上的再生芽数(2.98)；哈尼草莓在R2上的再生频率为75.14%，高于R1上的再生频率(71.33%)，每叶片平均再生芽数R2上的为3.29也高于R1上的再生芽数(2.43)；章姬草莓在R2上的再生频率为61.13%，高于R1上的再生频率(56.13%)，每叶片平均再生芽数R2上的为2.83，也高于R1上的再生芽数(2.28)；美香莎草莓在R2上的再生频率为57.12%，高于R1上的再生频率(54.07%)，每叶片平均再生芽数R2上的为2.75，也高于R1上的再生芽数(2.09)。说明R2培养基较适宜草莓叶片的再生分化。

表2 不同培养基诱导4个草莓品种叶片不定芽的生长

2.2.2 不同培养基诱导4个草莓品种叶柄不定芽的生长 由表3可知，4种不同品种继代材料叶柄在同一培养基上诱导再生分化不同，红颜草莓再生频率最高，为23.39%，哈尼草莓的为18.88%，与红颜草莓的差异不显著(P>0.05)美香莎的再生频率最低，为15.59%，与红颜草莓的差异显著(P<0.05)；红颜草莓每叶柄平均再生芽数也最多，为2.61个，与其他3种草莓的差异不显著(P>0.05)，哈尼草莓再生芽数为2.53个，章姬草莓的再生芽数为2.42个，美香莎草莓的再生芽数为2.31个；从玻璃化程度上看美香莎的最严重，为28.59%。这说明在R1培养基上，红颜草莓无菌苗的再生频率及每叶柄平均再生芽数都是较好。在R2培养基上4种草莓再生频率不同，最高的是红颜草莓，再生频率为26.75%，与其他3种草莓的差异显著(P<0.05)；红颜草莓每叶片平均再生芽数也最多，为3.12个，与其他3种草莓的差异显著(P<0.05)；从玻璃化程度上看美香莎的最严重，为22.37%。这说明在R2培养基上，红颜草莓无菌苗的再生频率及每叶柄平均再生芽数都较好。

同一品种继代材料叶柄在不同培养基上诱导分化效果不同。由表3还可知，红颜草莓在R2上的再生频率为26.75%，高于R1上的再生频率(23.39%)，每叶柄平均再生芽数R2上的为3.12，也高于R1上的再生芽数(2.61)；哈尼草莓在R2上的再生频率为22.37%，高于R1上的再生频率(18.88%)，每叶柄平均再生芽数R2上的为2.87，也高于R1上的再生芽数(2.53)；章姬草莓在R2上的再生频率为17.95%，高于R1上的再生频率(15.97%)，每叶片平均再生芽数R2上的为2.51，也高于R1上的再生芽数(2.42)；美香莎草莓在R2上的再生频率为57.12%，高于R1上的再生频率(54.07%)，每叶片平均再生芽数R2上的为2.4，也高于R1上的再生芽数(2.31)。说明R2培养基比R1培养基较适宜草莓叶柄的再生分化。

表3 不同培养基诱导4个草莓品种叶片不定芽的生长

由表2和表3对比可以看出，在同一培养基上诱导同一品种的不同继代材料，再生率不同，对比R2培养基上叶片和叶柄的分化诱导发现：红颜草莓叶片再生频率高出叶柄再生频率53.65%，叶片再生芽数高出叶柄0.53；哈尼草莓叶片再生频率高出叶柄再生频率52.77%，叶片再生芽数高出叶柄0.42；章姬草莓叶片再生频率高出叶柄再生频率43.18%，叶片再生芽数高出叶柄0.32；美香莎草莓叶片再生频率高出叶柄再生频率41.94%，叶片再生芽数高出叶柄0.28。4种草莓叶片再生分化过程中玻璃化程度也远远小于叶柄，说明利用草莓无菌苗叶片更易获得再生苗(图1、图2)。

注：A：红颜叶片再生分化；B：红颜叶柄再生分化。

图1R1培养基诱导再生分化

Fig.1 Regeneration on R1 medium

注：C：红颜叶片再生分化；D：红颜叶柄再生分化。

图2R2培养基诱导再生分化

Fig.2 Regeneration on R2 medium

3 结论与讨论

我国虽然是草莓野生种质资源最丰富的国家，但大果型栽培草莓品种均是由国外引进，引进的资源逐渐被利用进行资源创新及特性研究，离体培养技术被应用于草莓种质资源的保存、快繁、再生及脱毒等[4-6]。邓群仙[13]等研究认为在相同条件下，鬼怒甘品种的茎尖生长速度明显快于丰香品种，长势明显强于丰香品种，但其丛生芽发生率低于后者。这与侯喜林等报道品种对离体培养中材料生长、分化等的影响一致。张东辉[14]研究呼和浩特市4种主栽草莓快繁时，增殖及移栽成活率高低依次是红颜，章姬，点雪，随珠草窗。本试验研究发现增殖倍数及生根数最多的也是红颜。不同草莓品种的组织、器官如叶片、叶柄、花药、茎等都可以用来作为外植体，得到再生植株，目前研究多以花药、叶片、匍匐茎为外植体。花药便于得到多倍体植株；叶片可诱导形成愈伤组织，但是植株叶片的苗龄不同、采集时间不同，再生能力也有差异[9-12,15-16]。董良早[3]研究认为再生力为30 d苗>匍匐茎繁殖的当年苗>1年苗。本试验主要是采用1.5～2 cm株高的无菌苗进行增殖培养。在增殖培养时，大量研究都是以MS为基本培养基。李晓亮[17]等以草莓茎尖为培养材料，MS为基本培养基，试验结果发现，在草莓茎尖组织培养过程中，草莓的分化、增殖、生根和生长发育受到不同因素的影响，效果差异比较大；王建湘[18]以MS为基本培养基，建立了草莓叶片的再生体系。本试验是在前期大量试验的基础上选择MS+0.5 mg/L BA+0.1 mg/L IBA+6 g/L琼脂+30 g/L蔗糖为基本培养基，诱导增殖倍数最高达7.767，生根数达11.100个，随着继代天数的增加，增殖倍数增加。而且培养过程中多数品种不易产生愈伤组织，伸展的叶片正常，红颜叶大而平展，绿色，叶厚。

利用无菌苗进行再生诱导时，利用其不同植株不同部位进行诱导效果不同[12,16]。牛红云[19]等采用草莓的幼嫩茎段为接种材料，研究发现可以诱导出愈伤组织，说明利用草莓的幼嫩茎段可以作为再生材料进行愈伤组织的诱导。向云发[20]等利用晶瑶草莓幼嫩叶柄为外植体，也诱导出愈伤组织，并再生分化出芽，说明可以利用叶柄建立草莓的离体再生体系。王建湘[18]借助离体培养技术，对草莓叶片开展了大量的再生技术研究，认为叶片比较适宜不定芽的诱导。本试验通过诱导4个品种叶片和叶柄的再生分化发现，叶片再生率最高的达到80.40%，高于叶柄诱导率53.65%。

不同草莓品种离体增殖培养的不同阶段，利用的激素种类和水平也不同，其离体培养和再生使用较多的激素有6-BA、2,4-D、NAA、IBA、KT、TDZ等。大量研究表明，随着激素浓度的变化，新芽诱导率、根诱导率、株高、成苗率、增殖倍数及不定芽诱导率等不同[21]。和秀云[22]等研究托特母草莓不定芽诱导过程中激素水平为0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，增殖阶段激素水平为6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L，以KT为细胞分裂素的试验中发现，使用KT容易出现愈伤组织，但后期难以分化成丛芽。袁惠燕[23]等对6种草莓进行研究得出，TDZ在浓度为1.0 mg/L时，与NAA组合适合于草莓愈伤组织分化。本试验研究发现适宜的再生分化的培养基为MS+3.0 mg/L BA+0.1 mg/L 2.4-D+6 g/L 琼脂+30 g/L蔗糖，在培养过程中发现另外一种培养基上玻璃化率较高，可能与激素配比有一定的关系，而且导致不定芽密集丛生、不易分离、芽成苗困难。周书利[24]研究发现草莓组培过程中，玻璃化苗的出现与组织培养过程中使用的封口膜、琼脂浓度及碳源相关，在一定范围内，与激素如6-BA及其浓度等无关。张敏[25]研究认为草莓组培过程中，组培苗的玻璃化程度与封口膜的透气性成反比；也受到琼脂用量的影响，当琼脂浓度为6 g/L时，组培苗的玻璃化程度较低；蔗糖也有利于玻璃化程度的降低。本研究认为，草莓玻璃化受到激素的影响，离体培养草莓容易产生玻璃化，具体机理和培养时的防止措施需要进一步开展相关的研究[26]。

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