泛耐药鲍氏不动杆菌氨基糖苷类耐药相关基因研究

鲍群丽 柯俊 胡芳 张利红 黄艳 程攀 彭紫檀 汪宏良

摘   要：目的  探讨泛耐药鲍氏不动杆菌氨基糖苷类抗菌药物耐药机制。方法  收集2014年湖北省黄石市中心医院住院患者中分离的20株泛耐药鲍氏不动杆菌，用mdfA测序确认菌种，再采用聚合酶链反应法分析16种氨基糖苷类药物获得性耐药相关基因。 结果  20株泛耐药鲍氏不动杆菌共检出4种氨基糖苷类获得性耐药基因，氨基糖苷类修饰酶基因aac（3）-Ⅰ阳性率15.00%;ant（3"）-Ⅰ阳性率20.00%;aph3'-Ⅰ阳性率100.00%;16SrRNA甲基化酶未检出;外排泵adeB基因阳性率95.00%。 结论 泛耐药鲍氏不动杆菌中携带的耐药基因和耐药表型相对应，对氨基糖苷类药物耐药与产aac（3）-Ⅰ、ant（3"）-Ⅰ、aph3'-Ⅰ修饰酶基因和获得外排泵adeB 2种耐药机制有关。

关键词：鲍氏不動杆菌;氨基糖苷类修饰酶基因;外排泵基因;泛耐药

中图分类号：R378                                  文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.05.025

文章编号：1006-1959（2018）05-0078-03

Study on Aminoglycoside Pan Resistance Related Genes of Acinetobacter Baumannii

BAO Qun-li，KE Jun，HU Fang，ZHANG Li-Hong，HUANG Yan，CHENG Pan，PEN Zi-Tan，WANG Hong-Liang

（Department of Clinical Laboratory，Huangshi Central Hospital，Huangshi 435000，Hubei，China）

Abstract：Objective  To investigate the mechanism of aminoglycoside Pan resistance of Acinetobacter baumannii.Methods  20 strains of Pan resistance Acinetobacter baumannii isolated from hospitalized patients in Huangshi central hospital of Hubei province in 2014 were identified by mdfA sequencing.Polymerase chain reaction was used to analyze the acquired resistance related genes of 16 aminoglycosides.Results  A total of 4 aminoglycoside-resistant Acinetobacter baumannii strains were detected in 20 Pan-resistant Acinetobacter baumannii strains.The aminoglycoside modifying enzyme gene aac（3）-I was positive in 15.00%;ant（3"）-I The positive rate was 20.00%;aph3'-I，the positive rate was 100.00%;16S rRNA methylase was not detected;the positive rate of adeB gene of the efflux pump was 95.00%.Conclusion  The drug-resistance genes in pan-resistant Acinetobacter baumannii correspond to drug resistance phenotypes，and they are resistant to aminoglycosides and produce aac（3）-I，ant（3"）-I，aph3'-I the modification of the enzyme gene and the acquisition of efflux pump adeB are related to two drug resistance mechanisms.

Key words：Acinetobacter baumannii;Aminoglycoside modifying enzyme gene;Efflux pump gene;Pan-resistance

继临床分离到多药耐药的鲍氏不动杆菌（MDRAB）后，更严重的泛耐药鲍氏不动杆菌（XDRAB）与极度耐药鲍氏不动杆菌（PDRAB）在国内外都有分离报告[1-3]。为全面了解XDRAB氨基糖苷类抗菌药物耐药机制，我们对分离自湖北省黄石市中心医院20株XDRAB进行了9种氨基糖苷类修饰酶基因、6种16SrRNA甲基化酶基因以及外排泵adeB基因检测，现报道如下。

1资料与方法

1.1 细菌来源  20株XDRAB均分离自2014年1月～12月黄石市中心医院住院患者各种标本鉴定的菌株，每位患者一株菌。

1.2 菌种鉴定和药敏试验  全部XDRAB经鲍氏不动杆菌种特异基因mdfA检测确认。药敏试验采用K-B纸片琼脂扩散法测定菌株对抗菌药物的抑菌环直径。药敏纸片为英国Oxoid公司产品，培养基为法国生物梅里埃公司产品，结果判断按美国临床实验室标准协会（CLSI）2013版执行。

1.3细菌DNA制备  蛋白酶K水解离心快速裂解法。

1.4基因检测  耐药元件检测均为聚合酶链反应（PCR）法（全部PCR引物和商品化PCR盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供）。20株XDRAB耐药元件检测项目：9种氨基糖苷类修饰酶基因aac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（6'）-Ⅰad、aac（6'）-Ⅰb、aac（6'）-Ⅱ、ant（2"）-Ⅰ、ant（3"）-Ⅰ、ant（4'）-Ⅰ、aph3'-Ⅰ;6种16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA;1种获得性外排泵泵蛋白基因adeB，靶基因引物识别序列和目的产物长度，见表1。

2结果

2.1 XDRAB药敏试验  20株XDRAB对17种抗菌药物：哌拉西林、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美洛培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、复方新诺明、氯霉素、米诺环素、四环素、多粘菌素。耐药率：除了对多粘菌素全部敏感外，对其他抗菌药物耐药率均在80.00%以上。

2.2泛耐药鲍氏不动杆菌标本临床来源分布情况及患者基本情况  20株泛耐药鲍氏不动杆菌中，12株来源于重症监护病房，8株来源于神经外科病房，多为气管插管、导尿管的使用、导管留置时间延迟等各种侵入性操作的患者。

2.3 基因检测结果  20株泛耐药鲍氏不动杆菌共检出4种氨基糖苷类获得性耐药基因，氨基糖苷类修饰酶基因aac（3）-Ⅰ阳性率15.0%;ant（3"）-Ⅰ阳性率20.0%;aph3'-Ⅰ阳性率100.00%;16SrRNA甲基化酶未检出;外排泵adeB基因阳性率95.0%，见表2。

2.4  阳性耐药基因PCR电泳图  阳性耐药基因（aac（3）-Ⅰ、ant（3"）-Ⅰ、aph3'-Ⅰ、adeB）PCR电泳图，见图1。

3讨论

临床致病菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药机制主要为[4-8]：①氨基糖苷类修饰酶基因的产生;②外膜蛋白的通透性改变以及药物外排泵的激活和过度表达;③核糖体结合位点的改变，其中最常见的原因是耐药机制一。

鲍曼不动杆菌是医院内感染的重要病原菌之一，从我们的实验中可以看出，20株鲍曼不动杆菌中，3株aac（3）-Ⅰ基因阳性，4株ant（3"）-Ⅰ基因阳性，20株aph3'-Ⅰ基因阳性，提示我院多重耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药与携带耐药相关基因有关。

近年来，国外和我国台湾地区报道了在临床分离菌中发现了一类新耐氨基糖苷类抗菌药物的酶16S rRNA 甲基化酶，由质粒介导，能使该类抗菌药物的作用靶位甲基化，使药物无法结合到细菌16SrRNA，导致所有该类抗菌药物高水平耐药[9，10]。由16S rRNA甲基化酶基因介导的高水平氨基糖苷类抗菌药物耐药引起学者越来越多的关注， 到目前为止， 已发现6种16SrRNA 甲基化酶（armA 、rmtA、rmtB、rm tC 、rmtD、npmA），本实验虽然未检出16SrRNA 甲基化酶基因，但依然要加强抗菌药物合理使用和医院感染控制， 避免16SrRNA甲基化酶基因的播散。

本次研究发现，耐药不动杆菌属中，外排泵基因数量高于不耐药不动杆菌属[11-13]，提示外排泵基因在细菌耐药表型中也起作用。本研究检测了adeB外排泵基因，adeB基因编码内膜外排泵，是鲍氏不动杆菌外排泵Ade ABC中重要的组成系统，本组19株adeB基因阳性，提示本院多重耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药与携带ade B外排泵基因有关。

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