早期肠内营养对创伤大鼠β-EP、TNF-α、IL-10的表达及免疫功能的影响

熊 睿，汪晓泊，殷生芝，海应措，张晓雯，朱 楠，王小明

0 引言

机体创伤后可表现为高代谢的负氮平衡及全身炎症反应状态，使机体遭受严重的损伤[1-2]。过度的炎性反应过后可出现过度抗炎反应，最终使机体出现免疫力低下，并导致全身感染等严重并发症的发生[3]。积极的肠内营养可改善创伤患者的预后[4]。本研究通过构建创伤大鼠模型，于发病后不同时间点给予肠内营养支持，并观察其对创伤大鼠TNF-α、β-EP、IL-10的表达及免疫功能的影响，为早期肠内营养治疗提供临床依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年清洁级Sprague-Dawley大鼠40只，雄性，体重250～400 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养环境温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，在清洁级环境下普食饲养，12 h交替光照。

1.2 实验主要试剂及仪器 ELISA试剂盒(江莱生物科技有限公司)，CD3+、CD4+、CD8+硫氰基荧光素标记的单克隆抗体(美国Becton-Dickinson公司)，流式细胞仪器(德国Beckman Dickinson公司)，士强(荷兰Nutricia公司)，EN输注泵(荷兰Nutricia公司)。

1.3 模型构建与分组 创伤大鼠模型构建：SD大鼠饲养适应1周后开始行手术，术前禁食12 h，1%氯胺酮麻醉，俯卧后备皮消毒，切开大鼠双侧后肢髋关节周围皮肤，分离结扎双侧股动脉、股静脉，于髋关节处行双侧股骨离断术，缝合创面皮肤。将大鼠仰卧，切开腹部皮肤，在胃部前壁植入带侧无菌孔硅胶管(外径1.5 mm)，荷包缝合固定，经腹部皮肤隧道孔穿出，固定于大鼠肩胛部皮肤，连接输液装置。

分组：40只SD大鼠随机分为4组，每组10只，A组为正常对照组，大鼠未做手术。B组为创伤对照组，C组早期肠内营养组，术后当日6 h后开始给予肠内营养，D组为延迟肠内营养组，术后次日开始给予肠内营养。

1.4 营养实施方案 采用士强作为标准肠内营养，该营养剂能量为4.18 kJ/mL，喂养前临时用温水混匀，将营养液热量密度控制为6.27 kJ/mL，使大鼠按照总热量752.4 kJ/(kg·d)计算。创伤后从营养管注入。A组：代谢笼中正常进食，能量与营养液相当。B组：代谢笼中正常进食，创伤后6 h开始喂食，能量与营养液相当。C组：创伤后6 h开始从营养管灌喂士强营养液，每天2次(10∶00和17∶00)。术后第1天给予标准热量的1/3，第2天给予标准热量的1/2，从第3天起给予全量，连续喂养7 d。D组：创伤第2天开始灌喂士强营养液，给予标准热量的1/3，第3天给予标准热量的1/2，第4天起给予全量，连续喂养7 d。

1.5 检测方法和指标 于实验前1 d及实验结束时，在无菌条件下采集血标本。用流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+水平；使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测β-EP、TNF-α、IL-10水平，严格按试剂说明书操作。

2 结果

2.1 早期肠内营养对创伤后大鼠淋巴细胞亚群的影响 结果显示，四组CD8+细胞数量差异无统计学意义(P>0.05)；B组术后CD4+细胞数量与CD4+/CD8+比值显著低于A组(P<0.05)；C组和D组CD4+与CD4+/CD8+比值相对于A组均有下降(P<0.05)，但均高于B组(P<0.05)；C组CD4+与CD4+/CD8+比值显著高于D组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠T细胞表型含量变化

注：*与A组比较，P<0.05(*1t=-5.181，*2t=-3.219，*3t=-1.841,*4t=-2.219，*5t=-4.325,*6t=-2.267)；#与D组比较，P<0.05(#1t=2.985,#2t=1.837)

2.2 早期肠内营养对创伤后大鼠炎性细胞因子的影响 结果显示，与A组比较，B组β-EP、TNF-α、IL-10均显著升高(P<0.05)。与B组比较，C组和D组β-EP、TNF-α水平均显著降低(P<0.05)，IL-10显著升高(P<0.05)。与D组比较，C组β-EP、TNF-α水平均显著降低(P<0.05)，IL-10显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组术后β-EP、TNF-α、IL-10水平比较

注：*与A组比较，P<0.05(*1t=18.010，*2t=21.537，*3t=16.327，*4t=-16781，*5t=-12.346，*6t=9.846，*7t=-12.343，*8t=-11.325，*9t=9.584；*与D组比较，P<0.05(#1t=-11.232，#2t=-9.346，#3t=11.034)

3 讨论

创伤是各种机械因素对人体组织或器官的损坏，创伤后可使机体出现代谢和免疫功能紊乱[5]。炎症反应是创伤后机体早期变化之一，严重的创伤后过强的炎症反应是机体损伤的重要机制，主要表现为全身炎性反应综合征(SIRS)，机体呈高分解代谢状态，以及多器官功能衰竭(MODS)、休克、脓毒症等创伤后并发症的发生[6-7]。深入研究创伤后炎症反应机制，可为创伤后全身性损害及并发症的防治提供新的思路和方法。

本研究选取的β-EP、TNF-α、IL-10分别是创伤炎症反应过程中具有代表性的生物活性调节因子、促炎及抗炎细胞因子，可对创伤后炎性反应的发生、发展进行综合而有效的评估。其中β-EP属于内源性阿片肽，由脑下垂体和丘脑下部所分泌的一种氨基化合物，生理情况下其与机体的镇痛、情绪、应激、免疫功能、胃肠道活动的调节、心血管系统的抑制等有关，在神经-内分泌-免疫调节网络中发挥双向联系的作用[8-9]。Maddila等[10]研究发现，创伤后大鼠血浆β-EP水平的升高及恢复的时间与创伤严重程度密切相关。研究显示，β-EP可增强兔脑出血模型单核细胞IL-1、IL-2、IL-8的表达，且表现出了与免疫功能变化一致的趋势[11]。TNF-α是一种炎症反应启动因子，由活化的单核/巨噬细胞产生，是一种引起组织损伤的重要促炎因子[12-13]。IL-10是目前发现的一种强效抗炎细胞因子，主要由Th2细胞产生，主要生理功能是抑制TNF-α、IL-6、IL-8等多种炎性细胞因子的活性，抑制集落刺激因子的合成，减轻机体炎症反应[14-15]。笔者对β-EP、TNF-α、IL-10进行观察，结果发现，创伤后大鼠β-EP、TNF-α、IL-10水平均显著高于正常对照组，提示β-EP、TNF-α、IL-10均参与了创伤后炎症反应过程。

创伤后的机体往往伴随严重的免疫功能紊乱，且免疫抑制程度与SIRS和创伤的严重程度呈正相关。Hua等[16]研究发现，重度颅脑损伤的大鼠72 h内可迅速发生免疫功能抑制，Th细胞(CD4+)、自然杀伤细胞(NK)显著减少，Th细胞与Ts细胞(CD4+/CD8+)比值降低，淋巴因子激活杀伤细胞活力下降。本研究显示，与正常对照组大鼠比较，创伤对照组大鼠CD4+细胞数量与CD4+/CD8+比值显著降低。提示创伤后大鼠确实存在免疫功能紊乱，与邓秋林等[17]的研究一致。

肠道是体内最大的免疫器官，创伤可导致肠道黏膜屏障损伤，肠黏膜细胞能量代谢障碍，肠蠕动减弱或停滞，肠黏膜黏液分泌较少，细菌移位[18]。本研究结果提示，经肠内营养治疗后，早期肠内营养组和晚期肠内营养组β-EP、TNF-α水平均显著降低，IL-10显著升高，CD4+与CD4+/CD8+比值均得到改善。表明肠内营养通过有效调节机体促炎和抗炎反应，减轻过度炎症反应对机体的损伤，同时提示肠内营养是一种改善机体免疫状态、控制感染的最简单有效的方法。这可能与士强中含有谷氨酰胺、精氨酸、ω-3不饱和脂肪酸等物质有关。谷氨酰胺可促进淋巴细胞的分化和增殖，调节机体的免疫应答、抗原识别和提呈，以及各类细胞因子的合成。精氨酸可刺激淋巴细胞的增殖，促进一氧化氮的合成，并可调节巨噬细胞和淋巴细胞分泌细胞因子。ω-3不饱和脂肪酸可增强细胞膜的稳定性，影响受体和配体的形成和结合、细胞运动等调节细胞因子的生成和释放，同时还可以通过降低PGE2、TXA2等花生四烯酸衍生物的合成来减轻机体炎性反应[19-20]。而早期肠内营养比晚期肠内营养更能改善机体的免疫功能，减轻机体免疫反应，这与早期肠内营养对肠道神经内分泌紊乱的调节，早期肠黏膜有效的刺激，肠道血液灌流的改善和肠黏膜细胞能量代谢的增强有关。当然也有不赞成早期肠内营养的观点，主要担心创伤早期肠道水肿、充血严重，运动和吸收功能较差，早期肠内营养会增加胃肠道负担，不利于疾病的康复。笔者认为，早期肠内营养应该循序渐进，本实验中首日给予标准剂量的1/3，次日给予1/2，第3日才给予全量。早期肠内营养的目的是在及时补充各类能量物质的同时，尽早给予胃肠道适宜的有效刺激，改善神经内分泌紊乱，调节肠道功能。

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