离子色谱柱后补液-脉冲安培法检测米卡芬净钠中残留盐酸羟胺

(华东理工大学化学与分子工程学院 分析测试中心，上海 200237)

米卡芬净钠是一种新型水溶性半合成脂肽类化合物，是继卡泊芬净之后美国FDA批准的第2种棘白菌素类抗真菌药物[1]，能够非竞争性抑制1,3-ß-D葡萄糖合成酶的活性从而抑制真菌细胞壁的合成[2]。它对深部真菌感染的主要致病真菌曲霉菌属和念珠菌属有广谱抗真菌活性[3]，因此对真菌细胞有较高的特异性[4]，因而对人体正常细胞影响不大[5,6]，相比于比传统两性霉素 B、伏立康唑、伊曲康唑等有较少的副作用。

盐酸羟胺是一种重要的工业有机化合物，常常作为药物的中间体或原料[7,8]，也是合成米卡芬净钠的一个重要原料。盐酸羟胺本身有毒性，对皮肤有刺激性。半数致死量(小鼠经口)408mg/kg，有腐蚀性。因此对米卡芬净钠成品中盐酸羟胺的残留需要严格控制。

盐酸羟胺的常用检测方法有滴定法[9]、分光光度计法[10-12]、光谱法[13,14]等，上述方法操作繁琐、灵敏度低、重复性差。盐酸羟胺也可以衍生后用液相色谱和气相色谱分析[15，16]，但操作要求高。作为有机阳离子，也可以直接用离子色谱电导检测器检测，但灵敏度无法满足药物残留的分析，且易受干扰。根据盐酸羟胺的特性，采用离子色谱阳离子分离，柱后补碱，用脉冲安培检测，则灵敏度比电导法提高几个数量级，干扰少，特异性好。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex ICS5000双系统多功能离子色谱仪(含AS-DP自动进样器，DC模块(脉冲安培检测器)，DP-5双泵)、Dionex IonPac CG16保护柱(4*50mm)、Dionex IonPac CS16分析柱(4*250mm)；Chromeleon6.8色谱工作站(Thermo Fisher Scientific，美国)；甲基磺酸(99.5%)；阿拉丁；盐酸羟胺对照品(98.5%)；北京百灵威科技有限公司；氢氧化钠溶液(50%)，Merck。

1.2 溶液的配制

1.2.1 淋洗液、衍生液的配制

准确量取5.2 mL甲磺酸，加水稀释至4000 mL，摇匀，即得30mmol/L甲磺酸溶液淋洗液；精密量取50%氢氧化钠溶液80 mL，加水稀释至2000 mL，摇匀，即得500mmol/L氢氧化钠衍生液。

1.2.2 对照品储备液的配制

精密称取盐酸羟胺对照品25.36mg，置100mL容量瓶中，加淋洗液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置200 mL容量瓶中，用淋洗液稀释至刻度，摇匀，作为盐酸羟胺对照品储备溶液(1.25μg/ mL)。

1.2.3 标准溶液的配制

精密量取盐酸羟胺对照品储备溶液3 、1 、1 、3 、2 mL，于100 、20 、10 、20 、10 mL容量瓶中，用淋洗液稀释剂稀释至刻度，摇匀，配成0.0375、0.0625、0.1250、0.1875、0.2500 μg/mL系列标准溶液。

1.2.4 供试品溶液的配制

精密称取供试品约250mg，置10mL容量瓶中，加淋洗液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.3 色谱条件

分析柱：Dionex IonPac CS16 (4*250mm)；保护柱：Dionex IonPac CG16 (4*50mm)；淋洗液：30mmol/L 甲磺酸溶液；稀释剂：同淋洗液；柱后衍生液：500mmol/L 氢氧化钠；进样量：25μL；柱温：30℃；淋洗液流速：1.0mL/min，衍生液流速：0.3mL/min，检测器：安培检测器，脉冲安培(糖四电位波形)，金电极，Ag/AgCl参比电极。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

盐酸羟胺属于有机阳离子，在强碱性条件下，采用糖的电位有很高的灵敏度，但是有机阳离子的分离，只能采用阳离子模式，因此，采用阳离子分离，柱后补碱方式，同时解决了分离和灵敏度的问题，盐酸羟胺只在酸性条件下稳定，中性和碱性不稳定，因此盐酸羟胺样品应在酸性溶液条件下保存。

2.2 专属性

在同一色谱条件下，对空白溶液、对照储备液、供试品溶液进样，所得色谱图如图1。由图1可知空白溶液的色谱图在盐酸羟胺峰位置处，并无干扰峰，故淋洗液不干扰供试品的检测。

图1 空白、对照储备液、供试品色谱图

2.3 线性关系

用1.2.3配置的溶液，连续进样，得到线性关系Y=6.4773x-0.0236。相关系数r2为0.9999，Y截距绝对值0.0236<0.7936×20%(100%点峰面积的20%)，符合要求，说明在0.0125μg/mL～0.25μg/mL范围内，线性良好。

2.4 检出限和定量限

取0.0375μg/mL作为定量限溶液，并且连续进样6次；精密量取对照品储备液1mL，置于100mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为检出限溶液。以信噪比分别为3和10 计算，得到盐酸羟胺检出限及定量限见表1 。

表1 检出限和定量限的结果

2.5 回收率

精密称取约250mg的供试品于10mL的容量瓶中，再加入一定量的对照溶液，定容，配置成回收率溶液。按上述条件连续进样，所得结果见表2。由表2可知盐酸羟胺的回收率为97.5%，在80.0%～120.0%之间；RSD为2.8%，小于10.0%，说明本方法的准确度较好。

表2 回收率测定结果

2.6 进样精密度

取回收率项下对照品溶液作为进样精密度溶液，连续进样6针，得到盐酸羟胺含量的平均值为0.0005%，RSD为2.1%(n=6)，说明进样精密度较好。

2.7 溶液稳定性

将专属项下对照品溶液在室温下放置0h、12h、20h、24h再检测。精密精密称取供试品(No161201)251.5mg，置10mL量瓶中，精密量取盐酸羟胺对照品储备溶液1mL上述量瓶中，用淋洗液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液稳定性溶液，于室温放置，在0h、12h、20h、24h检测定。其结果如表3，从表3可以看出，在室温下放置不同时间后，无论是对照品溶液还是供试品溶液，峰面积变化非常小，因此溶液稳定性良好。

表3 溶液稳定性结果

2.7 样品测定

精密称取批号No161201、No161202、 No161203分别为 249.8mg、248.5mg、251.2mg，置于10mL容量瓶中，加淋洗液溶解并稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件，连续进样。从表4中可看出，3批样品中均为检测出盐酸羟胺，说明米卡芬净钠中未含有残留的盐酸羟胺。

表4 样品中盐酸羟胺的含量

3 结论

上述实验结果表明，通过离子色谱柱后补液-脉冲安培法能准确地分析米卡芬净钠中残的痕量盐酸羟胺的含量，而且此方法灵敏度高、稳定性好、重复性满足实验要求。

[1]FENG G, XU Y, CHEN J, et al. Application of an aculeacin A acylase from Actinoplanes utahensis SW1311 in syntheses of echinocandins[J]. 浙江大学学报 (农业与生命科学版), 2017, 43(4): 416-424.

[2]杨昊, 庞庆林, 钱文静. 注射用米卡芬净钠无菌检查方法研究[J]. 江苏科技信息, 2016, (27): 34-37.

[3]熊严, 邹树平, 崔建卫, 等. 棘白菌素类抗生素生物合成研究进展[J]. 精细与专用化学品, 2016,(6): 28-32.

[4]Kanda M，Yarnamoto E，Hayashi A，et a1.Scale-up fermenta-tion of echinocandin type antibiotic FR901379EJ3.Journal of Bioscience and Bioengineering，2010，109(2)：138-144.

[5]Kraas F I，Helmetag V，Wittmann M，et a1.Functional dis-section of surfactin synthetase initiation module reveals insights into the mechanism of lipoinitiation[J].Chemistry&Biology， 2010，17(8)：872-880.

[6]Pfaller MA，Boyken I.，Hollis RJ，et a1.In vitro susceptibility of clinical isolates of Aspergillus spp.to anidulafungin， easpofungin，and micafungin：a head-to-head comparison using the CLSI M38-A2 broth microdilution method[J].Clin Microbiol，2009，47(10)：3323-3325.

[7]Bott C, Hamilton C, Roth G. Process for the Preparation of 5-Substituted-8-alkoxy[1,2,4]triazolo [1,5-c]pyrimidin-2-amines: WO, 2011149861 [P]. 2011-12-01.

[8]FENG J，ZHANG Z，WALLACE M B，et a1.Discovery of alogliptin：a potent，selective，a bioavailable，and efficacious inhibitor of dipeptidyl peptidase IV[J].Journal of Medicinal Chemistry，2007，50(10)：2297-2230.

[9]李京雄, 温欣荣, 吴秀萍. 磷钼酸铵分光光度法测定盐酸羟胺[J]. 分析试验室, 2013, 32(3): 86-88.

[10]林仁权, 厉志玉, 胡文兰. 动力学分光光度法测定盐酸经胺[J].上海预防医学杂志,2008,20(7):355-361.

[11]衷明华. 共振光散射法测定盐酸经胺[J]. 光谱实验室,2012,29(4):2019-2011.

[12]袁君君. 紫尿酸-Fe (Ⅲ) 分光光度法测定盐酸羟胺[J]. 化学分析计量, 2014, 23(6): 49-51.

[13]姚东梅, 杨丽萍, 李香. 金纳米花-共振瑞利散射光谱法测定盐酸羟胺的含量[J]. 南方农机, 2017, 48(10): 1-3.

[14]徐晨. 离子色谱法测定灭多威中的盐酸羟胺[J]. 现代农药, 2017 (2017 年 01): 36-37, 40.

[15] 丁宏伟, 陈国广, 任丽莉, 等. 利培酮中盐酸羟胺的柱前衍生化-GC 法测定[J]. 中国医药工业杂志, 2016 (04): 454-456.