二化螟两种P450基因CYP4M38和CYP4M39的时空表达分析

白　琪，鲁艳辉，郑许松，吕仲贤，*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华321004；2.浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所，省部共建浙江省植物有害生物防控国家重点实验室培育基地，浙江 杭州310021)

细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)作为最古老和最庞大的超基因家族，是由数量众多、功能复杂的一类血红蛋白酶基因组成，广泛存在于动物、植物和微生物等生物体内，其酶系是昆虫中涉及抗药性的三大主要代谢解毒酶类之一。细胞色素P450在昆虫的生命过程中有多种功能，主要包括参与杀虫剂和植物次生物质的代谢以及蜕皮激素、保幼激素、性信息素的合成，与昆虫的生长、发育以及防御密切相关[1]。细胞色素P450在昆虫中多存在于中肠、脂肪体和马氏管中[2]，昆虫通过集中于中肠的解毒酶系统对摄入的有毒物质(包括植物次生物质)快速代谢，而脂肪体有利于代谢经表皮或气管进入体内的有毒物质[3]。已发现的昆虫P450基因分属于CYP4、CYP6、CYP9、CYP12、CYP18、CYP28、CYP49、CYP300s和CYP400s家族[4]。近来，由于昆虫基因组序列可用性增加，越来越多的昆虫细胞色素P450基因被鉴定出来[5-6]。有研究表明，昆虫CYP4基因参与代谢外源化合物和形成杀虫剂抗药性，且在脂类物质代谢中起重要作用[7]。

二化螟(Chilosuppressalis)是我国乃至其他亚洲国家水稻产区的一种重要蛀杆害虫，为害可造成稻株枯鞘、枯心和白穗，严重影响水稻的质量和产量[8-9]。当前我国水稻二化螟防治主要仍以化学防治为主，但长期不合理使用化学农药，造成了稻田系统害虫天敌杀伤、生物多样性下降、害虫抗药性快速增加，进而导致稻田生态系统自然控制功能减弱，病虫害发生频繁，由此形成恶性循环。因此，探索更安全有效的二化螟生物防治新方法及其机制对促进水稻的可持续生产具有重要意义。本研究通过转录组测序并验证获得二化螟的两种细胞色素P450基因CsCYP4M38和CsCYP4M39，在此基础上分析这两种基因的时空表达谱，为进一步从分子水平研究二化螟细胞色素P450基因功能提供基础，以期为二化螟的综合防治提供新思路。

1　材料与方法

1.1　供试昆虫

二化螟种群于2015年3月采自浙江省金华市郊(29°04′N，119°38′E)，置于人工气候室饲养并维持种群，温度(26±1)℃，相对湿度70%±5%，光周期14 h∶10 h。幼虫采用人工饲料饲养[10]，羽化后的成虫以10%的蜂蜜水补充营养。

1.2　实时荧光定量PCR测定CsCYP4M38和CsCYP4M39基因的表达

不同发育阶段样本：收集不同发育阶段的健康且大小一致的二化螟样本，包括卵(约500粒卵)，1-6龄幼虫(蜕皮后第1天的幼虫，饥饿3 h)，第1天的蛹，雌雄成虫(第1天羽化的成虫)。试验设置3个生物学重复。

不同组织样本：收集二化螟3龄幼虫，饥饿3 h后在预冷的pH 7.2的PBS缓冲液中解剖，收集头、中肠、脂肪体和表皮4部分组织，试验设置3个生物学重复，每个重复10头。

总RNA提取：利用Trizol试剂(Invitrogen)提取所有样本总RNA，具体步骤参照Trizol试剂说明书。取1 μL RNA样品测定D260/D280(Nanodrop 2000)，比值介于1.8～2.2的样品用于cDNA合成。

cDNA合成：取3.0 μg 总RNA，利用Oligo dT进行cDNA合成，操作步骤参照Thermo Fisher反转录试剂盒说明书。cDNA置于-20 ℃保存以供real-time PCR使用。

将所有样本按照上述步骤提取总RNA，反转录合成cDNA，以二化螟β-tubulin基因(GenBank登录号：EU429675)为内参基因，分别对CsCYP4M38基因和CsCYP4M39基因mRNA表达量进行real-time PCR检测。反应体系20 μL: SYBR(Bio-Rad)10 μL，上下游引物各1 μL(表1)，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95 ℃预变性10 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环，制作熔解曲线，确定扩增产物的特异性。每个样本2个技术重复。

1.3　数据分析

序列同源性比对利用ClustalW软件(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)完成。利用Mega 6.0软件建立系统发育树。Real-time PCR数据采用2-ΔΔCT方法处理，差异显著性采用DPS软件分析(P≤0.05)。

2　结果与分析

2.1　二化螟与其他昆虫P450基因的同源性分析

利用ClustalW软件将二化螟CsCYP4M38、CsCYP4M39基因与NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中注册的部分昆虫的P450基因的氨基酸序列进行同源性分析，结果表明，CsCYP4M38与其他昆虫的P450基因的氨基酸序列一致性在52.88%～56.86%，其中与烟草天蛾ManducasextaMsCYP4M2氨基酸序列同源性最高，CsCYP4M39与其他昆虫的P450基因的氨基酸序列一致性在53.78%～59.96%，其中与烟草天蛾MsCYP4M1氨基酸序列同源性最高(表1)。

2.2　部分昆虫P450基因的系统发育树

采用Mega 6.0软件对二化螟CsCYP4M38、CsCYP4M39基因及NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中注册的部分昆虫P450基因的氨基酸序列构建了系统进化树(图1)，进化树显示两个大的分支，第一个大的分支中包括CYP6家族和CYP9家族，第二个大的分支为CYP4家族。从进化树上可以看出，CsCYP4M38与CsCYP4M39属于CYP4家族，且分别与MsCYP4M2和MsCYP4M1进化距离较近，聚类正确。

2.3　CsCYP4M38和CsCYP4M39在二化螟不同发育历期表达分析

表1二化螟CsCYP4M38和CsCYP4M39氨基酸序列与8种昆虫P450基因氨基酸序列的同源性比较

Table1Percent identities of amino acid residues amongCsCYP4M38，CsCYP4M39 ofChilosuppressalisand P450 of other eight insects

基因名称GeneNameBmCYP4M5BmCYP4M9MsCYP4M1MsCYP4M2HzCYP4M6HzCYP4M7CmCYP4M25CsCYP4M38CsCYP4M39MbCYP4M61.0354.6762.4352.4968.4664.7456.5752.8853.78BmCYP4M5—53.2867.4055.0763.6760.5657.5754.8754.58BmCYP4M9—57.7461.8355.0953.9853.9854.8555.78MsCYP4M1—55.0762.8761.5561.1654.3759.96MsCYP4M2—53.6952.3953.1956.8653.98HzCYP4M6—65.4757.2956.2956.49HzCYP4M7—56.5756.3753.98CmCYP4M25—55.7854.98CsCYP4M38—54.18

MbCYP4M，甘蓝夜蛾Mamestrabrassicae， KX008607；BmCYP4M5，家蚕Bombyxmori， EF528484；BmCYP4M9，家蚕Bombyxmori， EF017796；MsCYP4M2，烟草天蛾Manducasexta， L38671；MsCYP4M1，烟草天蛾Manducasexta， GU731525；HzCYP4M6，美洲棉铃虫Helicoverpazea， AY113687；HzCYP4M7，美洲棉铃虫Helicoverpazea， AY113688；CmCYP4M25，稻纵卷叶螟Cnaphalocrocismedinalis， KP001139;CsCYP4M38，二化螟Chilosuppressalis， KF701163；CsCYP4M39，二化螟Chilosuppressalis， KF701164。

Bm， 家蚕Bombyx mori， BmCYP9A21 (EF415298)， BmCYP9A19 (EF488994)， BmCYP9A22 (EF491004)， BmCYP6AB5 (EF570076)， BmCYP4M5 (EF528484)， BmCYP4M9 (EF017796)， BmCYP6A8 (GQ241737); Ha， 棉铃虫Helicoverpa armigera， HaCYP6B7 (HM042304)， HaCYP9Ax(JX486677); Cm， 稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis， CmCYP4G112 (KP001142)， CmCYP4M25 (KP001139); Dm， 黑腹果蝇Drosophila melanogaster， DmCYP6A8 (AF387659)， DmCYP6A2 (U78088); Pc， 加拿大虎纹凤蝶Papilio Canadensis， PcCYP6B25 (AF278603); Ag， 棉蚜Aphis gossypii， AgCYP6A14 (KR028424)， AgCYP6A13 (KR028423)， AgCYP6A2 (KR028422); Ms， 烟草天蛾 Manduca sexta， MsCYP4M2 (L38671)， MsCYP4M1 (GU731525); Cq， 致倦库蚊Culex quinquefasciatus， CqCYP9M10 (AB332027)， CqCYP6BB3 (AB334749)， CqCYP6M12 (AB334748)， CqCYP6Z10 (AB334747); Md， 家蝇Musca domestica， MdCYP6A37 (DQ642010)， MdCYP6A36 (DQ642009)， MdCYP6D1 (U15168); Mb， 甘蓝夜蛾Mamestra brassicae， MbCYP4M(KX008607)， MbCYP9A(KR676343); Hz， 美洲棉铃虫Helicoverpa zea， HzCYP4M6 (AY113687)， HzCYP4M7 (AY113688); Pg， 北美黑条黄凤蝶Papilio glaucus， PgCYP6B4 (U47059); Cs， 二化螟Chilo suppressalis， CsCYP4M38 (KF701163)， CsCYP4M39 (KF701164)。图1　二化螟CsCYP4M38、CsCYP4M39与其他昆虫已知P450的系统发育树Fig.1　Phylogenetic analysis of CsCYP4M38， CsCYP4M39 and P450 gene sequences from some insect species

CsCYP4M38基因和CsCYP4M39基因在二化螟不同发育历期的表达量测定结果表明，两种基因在二化螟不同发育历期均有表达，但是表达水平随着二化螟发育历期的变化而变化。CsCYP4M38基因表达量由高到低依次为5龄幼虫、2龄幼虫、雌成虫、蛹、3龄幼虫、4龄幼虫、6龄幼虫、雄成虫、卵、1龄幼虫；且在5龄幼虫、2龄幼虫及雌成虫中的表达水平显著高于其他发育历期；3龄幼虫、4龄幼虫及蛹中的表达水平显著高于1龄幼虫中的表达水平；卵、1龄幼虫、6龄幼虫及雄成虫中的表达水平无明显差异。CsCYP4M39基因表达量由高到低依次为4龄幼虫、3龄幼虫、5龄幼虫、6龄幼虫、2龄幼虫、1龄幼虫、雌成虫、蛹、卵、雄成虫，表达量随龄期增加基本呈现出先上升后下降的趋势；4龄幼虫内表达水平达到最高；在3～6龄幼虫中表达量显著高于卵及雄成虫中的表达量；卵、1龄幼虫、2龄幼虫、蛹及雌雄成虫中的表达水平无明显差异(图2)。

2.4　两种P450基因不同组织表达分析

CsCYP4M38基因和CsCYP4M39基因在二化螟不同组织的表达量测定结果表明，两种基因在测定的4个组织中均有表达。CsCYP4M38基因表达量高低依次为脂肪体、表皮、中肠、头。CsCYP4M39基因表达量高低依次为脂肪体、中肠、表皮、头。两种基因在脂肪体内的表达水平均显著高于其他组织中的表达水平(图3)。

3　讨论

当前对昆虫细胞色素P450的研究主要集中在两个方面，一是P450对体内激素(包括保幼激素、蜕皮激素和信息素)等内源物质的合成与代谢；二是P450对外源有毒物质(如杀虫剂、植物的有毒物质)的代谢或激活[11]。如已证明至少6种P450(CYP302A1、CYP306A1、CYP307A1、CYP314A1、CYP315A1和CYP18A1)参与了果蝇(Drosophilamelanogaster)蜕皮激素的代谢，家蚕(Bombyxmori)CYP15C1在保幼激素的合成过程中起着重要作用[12]。细胞色素P450介导的杀虫剂抗药性已在果蝇(D.melanogaster)、冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)、家蝇(Muscadomestica)、赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、褐飞虱(Nilaparvatalugens)、烟粉虱(Bemisiatabaci)等昆虫中被普遍发现[13]。鉴于昆虫细胞色素P450对昆虫的生长发育具有重要作用，本文测定了二化螟两种细胞色素P450基因的时空表达谱，以期为二化螟细胞色素P450的功能研究提供基础。

卵，第5天的卵；一龄，第1天的1龄幼虫；二龄，第1天的2龄幼虫；三龄，第1天的3龄幼虫；四龄，第1天的4龄幼虫；五龄，第1天的5龄幼虫；六龄，第1天的6龄幼虫；蛹，第1天的蛹；雌蛾，第1天的雌成虫；雄蛾，第1天的雄成虫。数据处理以卵期CYP4M38和CYP4M39两种基因的表达量为基准进行计算，标准误由3次生物学重复计算得出，柱上无相同字母表示在DPS的One-Way ANOVA-Fisher’s LSD方法检验下差异显著(P≤0.05)。Egg， 5-day-old egg; 1st， 1-day-old 1st instar larva; 2nd， 1-day-old 2nd instar larva; 3rd， 1-day-old 3rd instar larva; 4th， 1-day-old 4th instar larva; 5th， 1-day-old 5th instar larva; 6th， 1-day-old 6th instar larva; PP， 1-day-old pupa; FA， 1-day-old female adult; MA， 1-day-old male adult. All the data were calculated based on the expression level of CYP4M38 and CYP4M39 in the egg stage. Standard error bars were based on three replicates. Bars marked without the same letters indicated significant difference through One-Way ANOVA-Fisher’s LSD method of DPS software(P≤0.05).图2　CsCYP4M38和CsCYP4M39基因在不同发育时期的相对表达量Fig.2　Developmental expression patterns of CsCYP4M38 and CsCYP4M39 genes

头、表皮、脂肪体、中肠分别代表3龄二化螟幼虫的头、表皮、脂肪体和中肠。每个处理三个重复。柱上无相同字母的表示在 DPS One-Way ANOVA-Fisher’s LSD 方法检验下差异显著(P≤0.05)。HD， Head; ED， Epidermis; FB， Fat body; MG， Mid gut. Every treatment was replicated 3 times. Bars marked without the same letters indicated significant differences through DPS One-Way ANOVA-Fisher’s LSD test(P≤0.05).图3　CYP4M38和CYP4M39基因在二化螟3龄幼虫不同组织的表达Fig.3　Tissue-specific expressions of CYP4M38 and CYP4M39 genes in the 3rd instar larvae of Chilo suppressalis

序列同源性分析结果发现，CsCYP4M38氨基酸序列与烟草天蛾MsCYP4M2氨基酸序列同源性最高，序列一致性高达56.86%；CsCYP4M39氨基酸序列与烟草天蛾MsCYP4M1氨基酸序列同源性最高，序列一致性高达59.96%。构建系统发育树显示，CsCYP4M38与CsCYP4M39属于CYP4家族，且分别与MsCYP4M2和MsCYP4M1进化距离较近，聚类正确。

细胞色素P450基因在昆虫不同发育阶段和组织器官中的表达存在差异性，使得这些基因的功能也不近相同[14]。有研究表明，黑森瘿蚊(Mayetioladestructor)随龄期的增加，其体内CYP4D1基因表达也升高，6龄幼虫表达量最高，在发育成蛹后其表达量迅速降低，在成虫期又略有提高[15]。同样，致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)中CYP4H34基因表达从卵期到幼虫末期逐渐增加，在蛹期急剧下降，成虫期表达量仍低[16]。二化螟CsCYP4M38和CsCYP4M39在不同发育阶段表达模式不同，CsCYP4M38在幼虫期的表达水平除1龄外均高于卵期及雄成虫，雌成虫内的表达水平仅低于2龄及5龄，表达峰值出现在5龄；CsCYP4M39在幼虫期的表达量均高于卵、蛹和成虫期，且在幼虫期表达量随龄期增加呈现先增加后下降的趋势，表达峰值出现在4龄。二化螟CsCYP4M39在蛹及成虫期表达量较少，这与摇蚊(Chironomustentans)的CYP4G33基因表达模式相似[17]。二化螟CsCYP4M38和CsCYP4M39在不同发育阶段的表达量变化，可能意味着昆虫代谢外源性物质的能力[18]，CsCYP4M38和CsCYP4M39的表达可能是二化螟发育各阶段所必需的，推测其可能参与二化螟生长发育过程中细胞和机体的生理代谢过程。

此外，有些P450基因存在特异性表达，如来源于家蝇(M.domestica)的CYP6D1只在成虫期表达，来源于棉铃虫(H.armigera)的CYP6B2只在幼虫期表达[19]，甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)CYP4S4仅在触角表达[20]。本研究中二化螟两种P450基因CsCYP4M38和CsCYP4M39的时空表达谱分析表明，这两种基因在二化螟所有测定的发育时期和组织中均有不同程度的表达，说明这两种基因的表达均不具备发育阶段特异性和组织特异性。基因的表达与其功能存在着一定的关系，二化螟CsCYP4M38和CsCYP4M39两种细胞色素P450基因均在脂肪体和中肠中的表达水平相对较高，这是因为在昆虫生长、发育和繁殖等过程中具有重要作用。如中肠是昆虫进行消化吸收的主要场所[21]，脂肪体可代谢糖类、脂类及蛋白质，同时也是激素作用的靶标组织[22]。

本研究通过对二化螟CsCYP4M38和CsCYP4M39两种基因的时空表达谱进行测定和分析发现，CsCYP4M38和CsCYP4M39在二化螟各发育阶段及测定组织中均有表达，并且在脂肪体中表达量最高，这可能与脂肪体是参与昆虫代谢的重要组织器官有关，这些结果提示CsCYP4M38和CsCYP4M39可能参与二化螟内源和外源物质的代谢作用。研究结果可为揭示二化螟细胞色素P450基因的分子功能和二化螟的有效防治提供科学依据。

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