HPV阳性宫颈癌和CIN患者血浆miR-150，SCCA及CA125的表达及临床意义

林丽慧，唐　梅，于春玲，林万妹

(海南西部中心医院妇产科，海南那大　571799)

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发生、发展和转归是一个极其复杂的多阶段、多基因调控异常的过程[1]。人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)发生的高危因素，而CIN是宫颈癌的癌前病变，早期诊断和治疗CIN对于预防宫颈癌有着重要的意义。研究表明，鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)及糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)对宫颈癌患者辅助诊断、病情监测、预后评估具有一定的临床价值[2]。近期的研究发现，miR-150与多种恶性肿瘤的发生有关，可能在肿瘤发生过程中发挥癌基因的作用[3，4]。本研究通过检测血浆miR-150，SCCA及CA125在HPV阳性宫颈癌患者中的表达情况，分析miR-150表达与宫颈癌临床病理特征间的关系，旨在为宫颈癌的早期诊断及靶向治疗提供依据。

1　材料和方法

1.1研究对象选取2015年1月～2017年9月海南西部中心医院妇产科收治的HPV阳性宫颈癌患者108例(宫颈癌组)，年龄31～75(48.16±10.52)岁。纳入标准：①符合国际妇产科联合会(FIGO)分类标准和WHO分级标准，且经病理确诊为宫颈癌者；②选取高危型HPV(HR-HPV)阳性者，如HPV16，18，31，33，35，39，45；③术前均未接受放射治疗、化疗及生物免疫治疗者。宫颈癌临床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期51例，Ⅲ期13例，Ⅳ期5例；病理类型：鳞状细胞癌98例，腺癌10例；病理分级：G1 16例，G2 39例，G3 53例；有淋巴结转移19例，无淋巴结转移89例。另取同期与宫颈癌患者年龄匹配的HPV阳性宫颈上皮内瘤样病变患者40例(CIN Ⅱ 13例，CIN Ⅲ 27例)作为CIN组和HPV单纯阳性或HPV阳性子宫良性病变者40例作为对照组。所有研究对象均于清晨空腹抽取静脉血5 ml，离心分离血浆后保存于-80℃冰箱待检。

1.2仪器和试剂RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)。贝克曼和罗氏电化学发光免疫分析仪及配套试剂盒，化学发光法测定SCCA和CA125水平。

1.3miRNA逆转录及RT-PCR检测取300 μl血浆样本，加入1 ml总miRNA提取液，按照血液总miRNA快速提取试剂盒(miRNeasy血浆提取试剂盒)说明书从血浆中提取总RNA。以U6为实验内参，miRNA逆转录反应体系：5 μl RNA模板，3 μl U6及miRNA特异性茎环引物，0.15 μl 100 mmol/L dNTPs(with dTTP)，1.00 μl逆转录酶(50U/μl)，1.50 μl 10×反转录缓冲液，0.19 μl RNase抑制剂(20 U/μl)，4.16 μl无菌三蒸水。反应条件：16℃ 30 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃保存，进行逆转录反应。以U6为实验内参，反应体系为20 μl：1.00 μl TaqMan Small RNA Assay(20×)溶液，10.00μl TaqMan⑧Universal PCR Master MixⅡ(2×)溶液，1.33 μl反转录产物cDNA，7．67μl DEPC水。扩增条件为：95℃10 min 1个循环，95℃ 15 s，60℃60 s进行40个循环，实验重复3次。每个反应体系中荧光信号达到所设定的阈值的经历的循环数即为Ct值，以U6为内参照，采用2-△△Ct法计算miR-150的相对表达水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

2　结果

2.1各组血浆miR-150，SCCA及CA125表达水平比较见表1。宫颈癌组血浆miR-150，SCCA及CA125表达水平均明显高于CIN组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)；CIN组血浆miR-150表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1

各组血浆miR-150，SCCA及CA125表达水平比较

2.2HPV阳性宫颈癌患者血浆miR-150表达与临床病理特征的关系见表2。随着宫颈癌临床分期的进展，miR-150表达水平逐渐升高，Ⅲ～Ⅳ期HPV阳性宫颈癌患者中miR-150表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期，差异有统计学意义(P<0.01)。血浆miR-150表达水平与淋巴结转移、浸润深度也相关(P<0.05)，而与年龄、病理类型、病理分级、肿瘤大小及绝经状态无关(P>0.05)。

表2

HPV阳性宫颈癌患者血浆

2.3血浆miR-150，SCCA及CA125对HPV阳性CIN的诊断价值见图1和表3。血浆miR-150，SCCA及CA125诊断HPV阳性CIN的曲线下面积(AUC)及95%CI分别为0.830(0.750～0.906)，0.703(0.625～0.781)，0.624(0.547～0.698)，与对照组(AUC=0.5)比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。血浆miR-150诊断HPV阳性CIN的最佳截值为3.46，敏感度和特异度为81.0%和80.2%。

图1　血浆miR-150，SCCA及CA125诊断HPV阳性CIN的ROC曲线

表3

血浆miR-150，SCCA及CA125对HPV阳性CIN的诊断价值

2.4血浆miR-150，SCCA及CA125对HPV阳性宫颈癌的诊断价值见图2和表4。

图2　血浆miR-150，SCCA及CA125诊断HPV阳性宫颈癌的ROC曲线

血浆miR-150，SCCA及CA125诊断HPV阳性宫颈癌的曲线下面积(AUC)及95%CI分别为0.881(0.801～0.964)，0.780(0.712～0.863)，0.679(0.602～0.754)，与对照组(AUC=0.5)比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。血浆miR-150诊断HPV阳性宫颈癌的最佳截值为8.25，敏感度和特异度为87.0%和84.3%。

2.5多元Logistic回归分析血浆miR-150，SCCA，CA125与HPV阳性宫颈癌的关系见表5。把宫颈癌组与对照组作为二分变量，以miR-150，SCCA及CA125作为自变量，应用多元Logistic回归模型对两组数据进行分析。结果显示，血浆miR-150和SCCA水平升高是HPV阳性宫颈癌发生的独立危险因素[OR(95%CI)=2.107(1.915～2.814)，OR(95%CI)=1.583(1.327～2.036)]。

表4

血浆miR-150，SCCA及CA125对HPV阳性宫颈癌的诊断价值

3讨论微小核糖核酸(microRNA，miR)是一类由18～25个核苷酸小分子组成的非编码单链小RNA，在肿瘤生理病理过程中发挥着重要的调控作用，有望成为一种新的疾病诊断、分类和预后判断的工具[5]。HPV检测是临床上筛查宫颈癌的常用方法，而HR-HPV与宫颈癌的发生发展密切相关[6]。HR-HPV主要通过早期表达的调节蛋白作用于宿主细胞的microRNA，引起宿主细胞生物学行为改变，进而导致宿主细胞发生癌变。有研究证实，血浆miR-150在多种恶性肿瘤中异常表达，是诊断恶性肿瘤患者的特异性标记物[7]。然而，血浆miR-150能否作为宫颈癌早期诊断的分子标志物，目前尚未明确。

表5

多元Logistic回归分析血浆miR-150，

本研究结果显示，宫颈癌组血浆miR-150，SCCA及CA125表达水平均明显高于CIN组和对照组，CIN组血浆miR-150表达水平明显高于对照组，Ⅲ～Ⅳ期患者血浆miR-150的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期。提示miR-150水平与宫颈癌的病情进展密切相关，可能参与宫颈癌的发生发展。Yin等[8]研究表明，miR-150对肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、凋亡及机体肿瘤免疫应答等方面发挥着重要的作用，并与恶性肿瘤的预后判断、临床病理分期及转移情况有关。Ghose等[9]研究认为，宫颈癌患者miR-150表达水平异常升高，miR-150通过调节基因表达水平促进宫颈癌细胞的增殖。另有研究表明，miR-150表达水平上调与宫颈癌组织中临床病理分期、淋巴结转移、血管侵犯、HPV感染和生存情况相关，它可以作为宫颈癌潜在的预后标志物和治疗靶点[10]。此外，进一步分析miR-150表达与宫颈癌临床病理特征的关系，发现有淋巴结转移及浸润深度>1/2肌层的宫颈癌患者miR-150表达水平明显升高，提示miR-150与HPV阳性宫颈癌患者的病情进展有关，分析其原因可能是存在淋巴结转移的患者肿瘤负荷往往较大，肿瘤组织可释放更多的具有原癌基因作用的microRNA进入血液，同时可抑制机体原有的具有抑癌作用的microRNA水平表达，进而导致机体microRNA表达水平异常升高；浸润越深的患者病情进展越快，肿瘤组织microRNA表达水平升高越明显。Li等[11]研究也证实，miR-150是宫颈癌病理过程的重要调节因子，miR-150上调可促进宫颈癌细胞的增殖，miR-150下调可抑制宫颈癌细胞的生长。

笔者应用ROC曲线分析，结果显示血浆miR-150对HPV阳性宫颈癌和CIN的诊断效能明显优于传统肿瘤标志物SCCA和CA125，其敏感度和特异度均较高。说明血浆miR-150在HPV阳性宫颈癌的早期诊断和CIN鉴别诊断方面具有一定的临床价值。Wang等[12]研究表明，microRNA作为一种新的生物标志物，可用于监测宫颈癌的进展和诊断HPV感染导致的宫颈癌。Liu等[13]研究发现，microRNA异常高表达与CIN分级和宫颈癌相关，是宫颈癌早期诊断和预后判断的可靠生物学标志物。本研究中，血浆miR-150和SCCA水平升高是HPV阳性宫颈癌发生的独立危险因素，而与年龄、病理类型、病理分级、肿瘤大小及绝经状态无关。提示miR-150可独立作为宫颈癌早期诊断的分子标志物。Liang等[14]研究认为，microRNA的异常表达与宫颈癌的淋巴结转移情况、化疗耐药性以及整体生存情况明显相关，它可以作为宫颈癌预后的重要评判指标。He等[15]研究也发现，miR-150在宫颈癌的发生、发展中发挥了一定的促进作用，有望成为宫颈癌早期诊断的潜在标志物。另有研究表明，血浆miR-150高表达对恶性肿瘤的总生存率有显著影响，它可作为恶性肿瘤诊断和预后评估的一种新型肿瘤标志物[16]。由此可见，血浆miR-150检测可作为宫颈癌筛查和辅助诊断方法，在HPV阳性宫颈癌中具有一定临床应用价值。

综上所述，血浆miR-150在HPV阳性宫颈癌患者中明显上调，与SCCA和CA125传统肿瘤标志物相比，其诊断HPV阳性宫颈癌的敏感度和特异度均较高，有望作为HPV阳性宫颈癌早期诊断和CIN鉴别诊断的新型分子标志物。但miR-150在宫颈癌的研究尚处于早期阶段， 有关miR-150表达异常在宫颈癌发生、发展中的作用机制及其调控机制仍有待进一步深入研究。

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