蓝莓花色苷抗氧化功能及稳定性研究进展

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(重庆市中药研究院,重庆 400065)

蓝莓为杜鹃花科越橘属多年生落叶或常绿灌木,富含花色苷、酚酸和类黄酮等多种活性物质,被联合国粮农组织(FAO)列为人类五大健康食品之一。蓝莓花色苷是花青素和糖以糖苷键结合而成的黄酮多酚类化合物[1]。花色苷具有未配对电子,是氢的供体,能有效清除多种活性氧自由基。国内外研究表明,花色苷具有广泛的药理作用,如促进视红素再生、抗炎、提高免疫力、抗氧化、延缓衰老、抗肿瘤等多种生理活性[2-3]。其中抗氧化功能越来越受到研究人员的重视。Hua Li等[4]的研究表明,包括蓝莓在内的5种不同浆果中均富含花青素和酚酸,具有强效的抗氧化、抗炎活性。常用的人工合成抗氧化剂如BHA(丁基羟基茴香醚)、BHT(二丁基羟基甲苯)和PG(没食子酸丙酯),已被证实对人体有毒副作用。目前国内外都在积极研究天然高效的抗氧化剂。但蓝莓花色苷抗氧化功能的研究大多停留在粗提取物及体外实验,且花色苷抗氧化机制的研究也较少,加之花色苷极不稳定,要甄别出高效稳定的花色苷难度较大。本文主要对蓝莓花色苷的有关研究进行综述,以期为蓝莓花色苷的进一步研究和开发利用提供参考。

1　蓝莓花色苷的结构与分类

花色苷是花青素与糖苷形式结合的化合物。花青素(anthocyanidin)的结构母核为2-苯基苯并吡喃阳离子,属于黄酮类化合物,其结构中存在2个苯环,形成共轭体系,故在紫外光区与可见光区(520～545 nm,275～285 nm)均由较强的吸收,结构如图1所示。现已知的花青素有20多种,主要存在于植物中的有天竺葵色素(Pelargonidin,Pg)、矢车菊色素或芙蓉花色素(Cyanidin,Cn)、翠雀素或飞燕草色素(Delphindin,Dp)、芍药色素(Peonidin,Pn)、牵牛花色素(Petunidin,Pt)及锦葵色素(Malvidin,Mv),除此之外还有芹菜素(Apigeninidin,Ap)。自然条件下游离状态的花青素极少见,花青素常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖在C3、C5、C7、C3′、C5′位以糖苷键相连形成花色苷,C3位是最常见的结合点,少数在C7位。花色苷分子含有极性基团,易溶于水、乙醇等极性溶剂。

表1　常见的花青素与花色苷的结构Table 1　Strucral identification of most common anthocyanidins and anthocyanins

图1　花青素的结构式Fig.1　General anthocyanidins structure

通常认为花色苷B环的结构对其稳定性影响很大,B环羟基化会导致花色苷体内降解为酚酸和乙醛,稳定性降低;B环甲氧基化能阻止有色的花色苷水化成无色的假碱,使得花色苷的稳定性升高;B环酰基化是指芳香族和脂肪族化合物与花青素C3结合形成较长的支链,避免了C2位受到亲核分子的攻击,C4位的取代基团也会加强其稳定性[5-7]。目前已知的天然花色苷有635种。蓝莓主要的花色苷为飞燕草色素、矢车菊色素、芍药色素、牵牛色素和锦葵色素[8]。花色苷的通式如图2所示,常见的花青素与花色苷的结构详见表1。蓝莓的品种繁多,抗氧化能力有一定的差异[9-10]。李颖畅等[11]的研究发现,从圣云蓝莓花色苷分离出的3种花色苷在抗脂质体过氧化、还原力、清除羟自由基能力、清除DPPH自由基能力有显著差异。

图2　花色苷结构通式Fig.2　General structure of anthocyanins

2　蓝莓花色苷的抗氧化能力测定方法

体外测定法包括基于电子转移的方法(SET)和基于H原子转移的方法(HAT)。SET主要是测定抗氧化物质维持氧化还原状态的能力,方法有二苯基苦苯肼自由基清除能力检测(2,2′-diphenyl-picrylhydrazyl radical,DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazo-line-6-sulphonate),ABTS)清除能力检测法、三价铁还原抗氧化剂的能力(ferric reducing anti-oxidant power,FRAP)等。HAT包括了氧化自由基吸收能力(Oxygen Radical Absorption Capacity,ORAC)、硫代巴比妥酸反应物法(Thiobarbituric Acid Reactive Substance Assay,TBARS)测定脂质过氧化物显色、总自由基清除抗氧化能力法(total radical-trapping antioxidative capacity,TRAP)等。王晓宇等[12]认为不同的测定法各有利弊,任何一种方法都仅测定了抗氧化能力的某一方面,而且不能模拟生理环境下的多条抗氧化途径。李敏等[8]测定不同花青素的抗氧化活性时发现的DPPH、FRAP结果一致,ORAC结果有所不同。

体内测定方法主要包括人体和动物实验以及细胞抗氧化实验。人体和动物实验是通过测定血清中的MDA、SOD、GSH-Px酶活性以及TAOC等来反应抗氧化能力。张名位等[13]证明ox-LDL能明显抑制内皮细胞活力,并呈浓度依赖关系,且不同花色苷对内皮细胞活力、MDA生成和NO释放差异显著。体内测定方法可以一定程度反应抗氧化物的活性,但郑影等[14]在蓝莓花色苷在体外和模拟人体胃肠环境的抗氧化活性研究中发现,在模拟人体胃肠环境中的吸收利用率很低,在肠液中的活性还不到原来的一半。Hussein M Ali测定了不同种花色苷的DPPH、ABTS+、羟自由基、FRAP的清除率以及相应Trolox当量值,数值越大则表明抗氧化活性越强,见表2[15]。

表2　某些花青素与花色苷的抗氧化及清除自由基能力Table 2　Radical scavenging activities and reducing power of anthocyanidins and anthocyanins

注：a:反应物的最终浓度,例如DPPH自由基清除率(%)(30.0 μmol/L)表明是在DPPH最终浓度为30.0 μmol/L的条件下测得,其余同;b:TEDPPH是指以Trolox标准液的总抗氧化能力为1,相同浓度情况下,其它物质的抗氧化能力用其抗氧化能力和Trolox相比的倍数来表示,其余同。

3　蓝莓花色苷的抗氧化功能

蓝莓中的抗氧化物质包括可溶性多糖、维生素C、还原性谷胱甘肽、总花色苷。其中总花色苷含量与DPPH自由基清除能力的相关性最强,说明蓝莓果实中总花色苷是抗氧化作用的重要部分[16]。蓝莓花色苷抗氧化作用体现在抑制脂质过氧化[17]、提高体内抗氧化酶类活性[18]、供电子还原自由基等方面。

3.1　抗氧化功能的构效关系

3.1.1B环上羟基的数目和位置大量研究表明黄酮类化合物B环上羟基的位置和数量极大地影响了其清除自由基的强度。花色苷提供氢离子与自由基还原后,其本身会形成新的自由基,新自由基稳定性越强则说明抗氧化能力越强。B环上的邻二羟基位置能与自由基形成稳定的共轭半醌式自由基,共轭半醌式自由基的电子云均匀分布降低了其分子内能,对二羟基与间二羟基无法与自由基形成邻苯醌的结构。更重要的是B环半醌式自由基与邻位羟基形成了分子内氢键导致苯氧自由基的稳定性大大增加。在蓝莓中普遍存在的花色苷的结构式中,可以看到其B环上存在大量羟基,尤其以C3′-C4′邻二羟基的活性最强。飞燕草花色苷的C3′、C4′、C5′均为羟基,与Long Y等[19]得出的飞燕草和飞燕草-3-葡萄糖苷在21种花色苷中对ox-LDL所致血管内皮损伤的保护作用效果最好的结论相一致。B环上的羟基主要起到直接清除自由基的作用,除此之外,C3-OH、C5-OH、C2′-OH、C7-OH也能够有效消除自由基[20-21]。B环的邻3′、4′二羟基能以氧负离子的形式与脂质过氧化链中的金属离子形成五元环螯合物,抑制脂质过氧化的发生。

3.1.2C环与A环的作用在黄酮类化合物通式中,C4位为羰基主要与邻位羟基络合金属离子抑制脂质过氧化反应,还存在C2和C3之间的双键结构,主要起着延长A、B环的共轭体系,提高结构稳定性。在花色苷中没有C4位的羰基,也没有C2和C3之间的双键结构,而在C3与C4中间是不饱和氢键,这使得C环表现为吸电子效应。在黄酮类化合物中A、C环的平面夹角为26°左右,尤其是拥有色原酮的结构中C环对A环的影响更大,会弱化A环中的酚羟基活性。不饱和C环延长了A、B的共轭体系,使苯氧自由基更加稳定。C环中的C3-OH同样能够提供氢与氧自由基反应。蓝莓主要的花色苷A环中在C5、C7均有羟基,Olenikov等[22]的研究表明A环中C5-OH、C7-OH与未被羟基基团取代的黄酮化合物相比,表现出很有效的螯合Fe2+能力。

3.2　抗氧化作用机制

3.2.2对酶的作用催化体内产生自由基的氧化酶包括NADPH氧化酶(NOX)、脂氧合酶(LOX)、醛氧化酶(AO)、黄嘌呤氧化酶(OX)等。经研究发现飞燕草素(Dp)、矢车菊素(Cy)、芍药花青素(Pn)、锦葵色素(Mv)及它们的糖苷对LOX-1和5-LOX的抑制作用,结果发现翠雀素葡萄糖苷和飞燕草半乳糖苷能够显著抑制LOX-1和5-LOX,对LOX-1的作用强于对5-LOX[25];林欢等[26]用Western蛋白免疫印迹法证实花色苷能抑制Bax和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表达,降低胞内ROS。另一方面蓝莓花色苷能够提高抗氧化酶的活性,Shih等[27]发现矢车菊素、飞燕草色素、锦葵色素不仅可以激活Nrf2作用于ARE,诱导Ⅱ相抗氧化蛋白谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、醌氧化还原酶1(NQ01)等的表达从而抑制半胱天冬酶-3(Caspase-3)的活性,而且能抑制LPS,通过作用 PI3K和 MAPKS途径,抑制前列腺素E(PGE2)和NO的产生。李颖畅等[20]在蓝莓对实验高血脂症大鼠影响的研究中发现,高剂量花色苷组高脂血症大鼠血脂水平和动脉粥硬化指数(AI)均有显著降低,血清和肝脏T-ACO和SOD、GSH-Px活性明显增加,MDA的生成量显著减少。

4　影响蓝莓花色苷稳定性的部分因素

4.1　光照、pH、温度

光对花色苷的影响是两方面的,首先是花色苷生物合成的重要因子,但同时光会加速花色苷的降解[29]。花色苷在自然光直射下褪色快,在避光条件下褪色慢[30-32]。方忠祥等[33]研究表明,光可加速紫薯花色苷降解。

花色苷随溶液中pH的变化而发生结构上的转化,在pH<2时,花色苷主要以红色的花色烊阳离子形式存在;pH在3～6时,花色苷主要以无色的甲醇假碱和查尔酮假碱的形式存在,在中性或者微酸环境下花色苷以紫色或浅紫色中性的醌式碱的形式存在,pH6～7时,形成紫色或蓝色的共振稳定的醌类阴离子[34]。Diego Luna-Vital等[26]研究玉米花青素的稳定性时,运用第一反应动力学计算发现pH<5时,随着pH的增加,花青素半衰期预测值明显降低,pH>5时，由于色度不成线性所以无法计算半衰期。花色苷只能在酸性条件下才能保持稳定[35-38]。

温度升高能加速花色苷的降解,其热解过程符合动力学方程,在50、70、90 ℃降解速率常数k分别为0.0263、0.0864、0.3604 h-1,热降解活化能Ea63.61 kJ·mol-1[39]。花色苷的热稳定性与其结构、pH等因素有关。花色苷在温度升高时,向着无色的查尔酮和甲醇假碱形式转化,当冷却和酸化时,醌式碱和甲醇假碱还可转化变成红色的花色烊阳离子形式。陆卿卿[22]认为在60 ℃以下花色苷的稳定性较好,加热4 h后,其花色苷的残留率达80%以上。Kechinski等[40]研究表明,蓝莓花青素在40 ℃下更稳定,在80 ℃时的损失速率是40 ℃时的36倍。李文安[37]对pH、温度、时间三因素进行三水平正交实验得出花色苷最稳定的条件是pH3.0,温度4 ℃,时间1.5 h。

4.2　金属离子

金属离子对花色苷有辅助显色的效果,不同的金属离子对不同种类的花色苷作用效果不同。李颖畅等[41]研究发现K+、Ca2+、Cu2+、Al3+对蓝莓花色苷的稳定性无显著差异,Mn2+、Na+、Zn2+可以提高其稳定性,Fe2+、Fe3+、Pb2+则会引起花色苷的稳定性下降。田密霞等[23]对比研究发现相同金属离子(Ca2+、Cu2+、Zn2+、Na+、Mg2+、Fe3+)对两种不同品种的蓝莓稳定性影响不同,其中Fe3+影响最为显著,两种蓝莓花色苷均因金属离子影响稳定性下降。李文安[37]研究发现Fe3+、Cu2+对花色苷稳定性影响较大。

4.3　提取条件

蓝莓花色苷的不同提取方式对花色苷的稳定性影响很大。在杨磊等[42]的研究中,对蓝莓匀浆提取过程中的各因素采用Plackett Burman和Box-Behnken实验设计进行优化,得到蓝莓花色苷的最佳提取工艺条件是pH2.5、乙醇体积75%、料液比1∶17 (g·mL-1)、提取时间20 s、提取次数1 次,在此条件下提取的总花色苷抗氧化活性最高。但在申芮萌等[43]在单因素实验的基础上,通过响应面实验,优化后得到的最佳工艺参数是料液比1∶8 (g·mL-1),甲醇体积分数63%,超声功率450 W,超声时间50 min。花色苷的提取工艺没有固定的标准,在摸索中有不同的提取条件。刘晨等[44]表明蓝莓酒渣花色苷的最佳提取条件为超声时间50 min、液料比33∶1 (mL/g)、提取温度65 ℃,这与陈云霞等[45]的研究结论不同。刘树勋等[46]表明蒸馏处理会显著影响野生蓝莓皮酒渣的总酚和花色苷总量。黄晓杰等[47]表明通过水杨酸处理蓝莓果实,能有助于保存总酚和花色苷的含量,增强抗氧化作用。

4.4　氧化剂、还原剂

蓝莓在加工过程中常会使用到O3和 H2O2作为食品杀菌剂,但残留浓度的增加会引起花色苷发生降解。因为O3和 H2O2会生成自由基类物质,花色苷与其结合后反应生成酚类和醛类。氧化剂浓度升高,花色苷残存率降低[23]。Na2SO3对蓝莓花色苷存在一定的破坏作用。随着时间的延长,蓝莓花色苷的残存率逐渐降低,且Na2SO3浓度越大,最终的残存率也越低[23]。

4.5　其他

有机酸通常在花色苷的C3位糖上结合,形成更稳定的酰基化花色苷。国内外均有关于酰基化提高花色苷稳定性的报道。Yawadio R等[48]研究发现芥子酸、阿魏酸、P-香豆酸能起到对黑米汁进行显色的作用。最新研究发现外源性脱落酸(ABA)处理可诱导的尿苷二磷酸葡萄糖类黄酮葡萄糖-玉米转移酶,谷胱甘肽S-转移酶4,O-甲基转移酶和类黄酮3′,5′羟化酶表达,增加花旗子、马鞭霉素花青素的总量[49]。

5　展望

目前蓝莓花色苷抗氧化功能的研究大部分还停留于粗提取物或混合物以及体外实验,甄别出高效稳定的花色苷难度较大。对黄酮类化合物的抗氧化研究较多,但对花色苷抗氧化机制的研究较少,应进一步研究花色苷的抗氧化特异性构效关系,将研究方向从共性深入到特性。制约蓝莓开发利用的主要因素是其花色苷极不稳定,导致其提取以及纯化率低。有资料显示,添加酚类、黄酮类化合物以及微胶囊化可以延长花青素的稳定性[50]。我国迄今尚未建立蓝莓产品作为保健食品开发或抗氧化药物生产的相关产品标准,导致市场上蓝莓产品抗氧化能力参差不齐[51],因此应进一步研究蓝莓花色苷的抗氧化作用机制和稳定条件,建立产品生产标准,保证其结构的稳定性和功能的有效性。

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