CD39在肿瘤免疫中的研究进展

李慧娟， 叶 亮， 张 方综述， 宋 勇审校

0 引 言

免疫系统是一个受到严格调控并且相互紧密联系的细胞网络，发挥着维持及修复机体内环境稳态的功能。然而，免疫系统的异常激活会造成邻近组织的损伤及各种病理生理过程的发生。嘌呤系统是一个高度进化的选择性系统，能够微调免疫细胞的功能，比如细胞与细胞间的相互作用，细胞因子和趋化因子的分泌，表面抗原的脱落，以及产生活性氧(reactive oxy gen species, ROS)等[1]。嘌呤介质ATP，在正常生理状态下，主要位于细胞内，浓度大约1～10mM，而在细胞外ATP浓度则处于很低的水平(10～100nM)。当机体出现组织紊乱的情况，包括炎症，缺氧，缺血，恶性肿瘤等，胞内的ATP会大量释放到胞外，既作为感觉信号又作为传出信号引发免疫反。 ATP释放到细胞外后，被胞外的核苷酸水解酶CD39水解转化为ADP和AMP,AMP再在CD73协同作用下去磷酸生成免疫抑制性的腺苷，并且CD39是这一过程的限速酶，腺苷激活免疫细胞表面的腺苷受体，介导嘌呤的免疫调节效应[2]。

1 CD39的表达及生物学作用

1982年Rowe等[3]研究首次发现EB病毒感染的B淋巴细胞表面存在一种特殊的分子标志物，随后被命名为CD39，该分子是一个整合的细胞膜蛋白，是一个钙镁离子依赖的胞外核苷酸水解酶，能水解ATP,ADP生成AMP。人类CD39是一个含有约510个氨基酸的蛋白，有7个N-糖基化位点及11个半胱氨酸残基与2个跨膜区域。在结构上，CD39由两个跨膜结构区域组成，一个小的胞质区域和一个大的胞外疏水区域，胞质区域含有N端和C端，胞外区域含有5个ATP酶保守区域(apyrase conserved regions， ACRs)，是维持该分子的酶活性、结构完整性必需的[4]。

CD39广泛表达于多种组织器官，如膀胱，脑，乳腺，结肠，子宫，胃，前列腺等，并且主要表达于内皮细胞和免疫细胞[5-7]。不同类型细胞CD39的表达也存在显著差异，B淋巴细胞，单核细胞和中性粒细胞CD39的表达率达90%以上，CD4+T细胞(包括记忆性T细胞和调节性T细胞)表达率约20%～30%，而CD8+T细胞表达率低于5%，自然杀伤细胞(natural killing cell，NK)表达率2%～5%[8]。

CD39的主要生物学作用是催化水解胞外二三磷酸核苷酸，目前研究较多的是催化水解细胞外的ATP为ADP及AMP。CD73，胞外-5′核苷酸酶(ecto-5′nucleotidase),一种通过糖基-磷脂酰肌醇锚定于细胞膜外的多功能糖蛋白，与CD39共同表达于细胞膜外，进一步催化水解AMP为腺苷。CD39是这一重要过程的水解限速酶，并且这一过程也是细胞外腺苷生成的主要来源[2]。有极少一部分腺苷是通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine di-nucleotide,NAD)糖水解酶水解细胞外的NAD，生成ADP核糖，进一步降解生成AMP,在CD73协同作用下生成腺苷。

2 CD39与肿瘤

CD39在许多恶性肿瘤中的表达水平是升高的[8-9]。Jeremy等[7]研究发现相对于正常组织，CD39在肾，肺，卵巢，胰腺，甲状腺等肿瘤组织中的表达水平显著升高，并具有统计学意义，暗示着CD39异常表达升高与恶性肿瘤的发生发展有关。CD39的表达受许多因素的影响，例如白细胞介素6(interlenkin-6, IL-6)[10]，IL-7[11]，IL-27[12]，转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)[13]，低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)[14]，stat3，独立的锌指蛋白生长因子1转录因子[15], 氧化应激[16]。目前已经有许多研究表明，CD39在肿瘤发生发展中扮演重要的角色。对肝肿瘤、胃肿瘤根治术后的患者，肿瘤组织CD39表达升高与较高的复发率和较短的生存期有关，是不良预后的独立危险因素[17-19]。CD39对肿瘤细胞的增殖和转移也有影响。Shaun等[20]研究发现CD39基因缺陷的小鼠皮下接种黑色素瘤细胞，接种瘤及肺部转移瘤的生长都受到显著的抑制，肿瘤血管的生成也明显减少。表达CD39的Treg细胞抑制NK细胞的细胞毒性作用和细胞因子的产生，抑制黑色素瘤肝转移瘤的生长[21]。而对CD39基因过表达的小鼠皮下接种结肠癌细胞，其肝转移瘤的数量及大小都是显著增强的[22]。

3 CD39与肿瘤免疫

越来越多的研究表明肿瘤细胞及其所处的微环境对肿瘤的发生发展至关重要，在肿瘤微环境中，肿瘤和免疫细胞密切接触释放许多免疫调节性的因子，形成一个免疫抑制性的微环境，从而促进肿瘤的生长。目前越来越多的研究指出CD39主要是通过产生腺苷，腺苷与肿瘤中浸润的免疫细胞上的4种G蛋白偶联的腺苷受体(A1,A2A,A2B,A3受体)结合影响其功能，从而形成免疫抑制性的微环境，促进肿瘤的发展[23]。

3.1单核吞噬细胞系统单核吞噬细胞系统，包括单核细胞，巨噬细胞和树突状细胞，是调节固有免疫和调节性免疫的重要组分，在炎症反应和宿主防御过程中发挥重要作用[24]。腺苷通过作用于单核吞噬细胞系统中细胞上的腺苷受体，影响其分化、成熟及激活[25]。

巨噬细胞主要有2种亚型，M1型和M2型。M1型巨噬细胞主要出现在慢性炎症部位。以释放促炎性的细胞因子为特征，如IL-1β，IL18，IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。肿瘤中浸润的巨噬细胞也称做肿瘤相关的巨噬细胞，主要为M2型的巨噬细胞，以释放抑炎性的细胞因子，如IL-10等，以及组织重构分子为特征，其通过抑制抗肿瘤的淋巴细胞介导的免疫效应以及促进基质的沉积和重塑，促进肿瘤细胞的增殖，转移及肿瘤血管的生成[26]。Zanin等[27]研究发现，抑炎性的M2型巨噬细胞表达CD39和CD73明显高于促炎性的M1型巨噬细胞，M2型巨噬细胞通过表面的核苷酸水解酶促进肿瘤微环境中腺苷的产生，自分泌的腺苷作用于巨噬细胞本身，增强其抑炎作用。腺苷主要作用于其表面的A2B受体，促进巨噬细胞的替代激活，上调M2型巨噬细胞标志分子，如精氨酸酶1，组织型基质金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP-1)和巨噬细胞半乳糖型C型凝集素1(macrophage galactose-type C-type lectin 1,mgl1)[28]。在黑色素瘤中，激活腺苷A1、A2A、A3受体能够调节巨噬细胞的分化，增强肿瘤中巨噬细胞的浸润，同时促进黑色素瘤的生长及血管生成[29]。

树突状细胞的分化和功能也受腺苷的调节[30]。异常的树突状细胞与其表面A2B腺苷受体的激活有关，单核细胞向树突状细胞分化过程中，腺苷作用与A2B受体，改变细胞的表型，使其介于单核细胞和树突状细胞的中间状态，上调促血管性、促炎性、免疫抑制性和免疫耐受性的因子，包括血管内皮生长因子、IL-8、IL-6、IL-10、环氧化酶-2、TGF-β和吲哚胺2,3-双氧酶。Cekic等[31]发现A2B受体能抑制树突状细胞的激活，更为重要的是，A2B受体能抑制树突状细胞的肿瘤抗原提呈作用，下调γ干扰素(interferon-γ, IFNγ)和IFNγ诱导的CXC趋化因子配体10(CXC-chemokine ligand 10,CXCL10)，抑制对T细胞的招募和活化，从而发挥免疫调节和免疫抑制作用。

3.2淋巴细胞T淋巴细胞是机体执行细胞免疫的主要细胞，在细胞免疫中抗原由抗原提呈细胞处理成多肽，与MHC结合后形成复合体，作用于T细胞表面的T细胞受体，在共刺激分子的协同作用下，激活T淋巴细胞，进一步增殖、分化，发挥效应功能。效应性T细胞的活化及效应过程均受腺苷的影响，腺苷作用于T细胞表面的A2A受体，引起一系列抑制性的T细胞效应[4]：①胞内cAMP水平升高，抑制T细胞受体介导的T细胞活化和增殖；②抑制效应性T细胞IL-2的分泌，IL-2的减少下调共刺激分子CD28和CD2的表达，从而抑制T细胞的增殖和对共刺激分子的反应；③抑制促炎性细胞因子的产生，如IFN-γ和TNF-α；④抑制细胞毒性的效应分子的产生，如穿孔素和Fas配体；⑤促进CD4+T细胞分化为调节性T细胞。

调节性T细胞(regulatory T cells, Treg )在对自身抗原免疫无应答和抑制异常免疫反应发挥重要作用的同时，也抑制了抗肿瘤的免疫反应，促进肿瘤的免疫逃逸[32]。在肿瘤微环境中，Treg细胞水平升高，Treg细胞表面高表达CD39,CD39逐渐被认为是Treg细胞表面的特异性标志分子[33]。Treg细胞表面的CD39发挥核苷酸水解酶的作用促进腺苷的产生，这也是Treg细胞发挥免疫抑制作用的重要过程。Treg细胞来源的腺苷，作用于效应性T细胞表面的A2A受体，抑制效应性T细胞的增殖、迁移及抗肿瘤效应[34-35]，作用于NK细胞表面的A2A受体，抑制NK细胞的细胞毒性作用和细胞因子的产生，介导一系列免疫抑制效应[36-37]。Treg细胞还能通过分泌携带CD39和CD73的外泌体抑制效应性T细胞的增殖和细胞因子的分泌[38]。另一方面，自分泌的腺苷反过来也能调节Treg细胞的功能，腺苷作用于Treg细胞表面的A2A受体促进Treg细胞的增殖，上调细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD-1)的表达，增强其免疫抑制功能[39]。

4 CD39成为肿瘤治疗的新靶点

CD39是免疫抑制性的腺苷产生过程中的重要限速酶，靶向CD39则可能成为一个新的肿瘤免疫治疗的方法。目前已经有许多研究发现抑制CD39能恢复受到抑制的抗肿瘤效应。在体外实验，将黑色素瘤细胞与PBMC共培养，抑制CD39活性能部分恢复效应性T细胞和NK细胞的细胞毒性作用[40]。在体内试验，B16黑色素瘤细胞和MCA-38结肠肿瘤细胞皮下接种小鼠，腹腔注射CD39的化学抑制剂POM1，5 mg或10 mg/kg,10 d，接种瘤的生长受到显著抑制。POM1的抑制作用与CD39基因缺陷的小鼠其接种瘤的生长受到抑制类似，但对CD39缺陷的老鼠腹腔注射POM1并不会进一步抑制肿瘤的生长，表明这一作用是POM1抑制了CD39而介导的。并且POM1处理小鼠过程中没有发现肝肾毒性的现象，也为CD39抑制剂的安全性提供了证据[21]。针对抑制CD39能下调免疫抑制性的腺苷，促进抗肿瘤效应，目前已经研发出了抗CD39单克隆抗体，主要有BY40和BA54G,能显著阻断CD39的酶活性[8]。Jeremy等[7]研究发现CD39阻断抗体BY40能逆转肿瘤对CD4+和CD8+T细胞增殖的抑制，上调细胞毒性的T淋巴细胞和NK细胞的细胞毒性作用。可见，利用CD39化学抑制剂、单克隆抗体在体内外实验中对肿瘤细胞生长的抑制和免疫细胞功能的恢复已经取得了显著疗效，这为抗肿瘤治疗提供了新途径。

5 展 望

CD39在肿瘤免疫中的作用已经有了一定的了解，大量研究均证实靶向CD39能抑制肿瘤细胞的增殖，逆转免疫细胞功能，增强免疫效应。CD39的免疫抑制作用主要是通过促进腺苷的产生介导的，腺苷与腺苷受体结合抑制抗肿瘤免疫，阻断这条作用链中的任一环节都能抑制CD39的免疫抑制性。近来，靶向多种免疫抑制性通路能协同性的增强抗肿瘤免疫效应。目前靶向CD39-腺苷通路的抗肿瘤治疗与其他抗肿瘤免疫治疗相结合在抗肿瘤治疗中收到广泛关注。已经有研究发现靶向腺苷A2A受体或者CD73能增强抗PD-1及抗CTLA-4单抗抗肿瘤效应，协同性得增强抗肿瘤免疫[8, 41-42]。但是目前还没有研究发现靶向CD39与其他免疫治疗联用能否进一步增强抗肿瘤效应，还有待进一步研究发现。

[1] Di Virgilio F, Adinolfi E. Extracellular purines, purinergic receptors and tumor growth[J]. Oncogene, 2017,36(3):293-303.

[2] Faas MM, Saez T, de Vos P. Extracellular ATP and adenosine: The Yin and Yang in immune responses?[J] Mol Aspects Med, 2017,55:9-19.

[3] Rowe M, Hildreth JE, Rickinson AB,etal. Monoclonal antibodies to Epstein-Barr virus-induced, transformation-associated cell surface antigens: binding patterns and effect upon virus-specific T-cell cytotoxicity[J]. Int J Cancer, 1982,29(4):373-381.

[4] Cekic C, Linden J. Purinergic regulation of the immune system[J]. Nat Rev Immunol, 2016,16(3):177-192.

[5] Allard B, Beavis PA, Darcy PK,etal. Immunosuppressive activities of adenosine in cancer[J]. Curr Opin Pharmacol, 2016,29:7-16.

[6] Antonioli L, Blandizzi C, Pacher P,etal. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine[J]. Nat Rev Cancer, 2013,13(12):842-857.

[7] Bastid J, Regairaz A, Bonnefoy N,etal. Inhibition of CD39 enzymatic function at the surface of tumor cells alleviates their immunosuppressive activity[J]. Cancer Immunol Res, 2015,3(3):254-265.

[8] Allard B, Longhi MS, Robson SC,etal. The ectonucleotidases CD39 and CD73: Novel checkpoint inhibitor targets[J]. Immunol Rev, 2017,276(1):121-144.

[9] Bastid J, Cottalorda-Regairaz A, Alberici G,etal. ENTPD1/CD39 is a promising therapeutic target in oncology[J]. Oncogene, 2013,32(14):1743-1751.

[10] Sanmarco LM, Ponce NE, Visconti LM,etal. IL-6 promotes M2 macrophage polarization by modulating purinergic signaling and regulates the lethal release of nitric oxide during Trypanosoma cruzi infection[J]. Biochim Biophys Acta, 2017,1863(4):857-869.

[11] Younas M, Hue S, Lacabaratz C,etal. IL-7 modulates in vitro and in vivo human memory T regulatory cell functions through the CD39/ATP axis[J]. J Immunol, 2013,191(6):3161-3468.

[12] Mascanfroni ID, Yeste A, Vieira SM,etal. IL-27 acts on DCs to suppress the T cell response and autoimmunity by inducing expression of the immunoregulatory molecule CD39[J]. Nat Immunol, 2013,14(10):1054-1063.

[13] Li J, Wang L, Chen X,etal. CD39/CD73 upregulation on myeloid-derived suppressor cells via TGF-beta-mTOR-HIF-1 signaling in patients with non-small cell lung cancer[J]. Oncoimmunology, 2017,6(6):e1320011.

[14] Bullen JW, Tchernyshyov I, Holewinski RJ,etal. Protein kinase A-dependent phosphorylation stimulates the transcriptional activity of hypoxia-inducible factor 1[J]. Sci Signal, 2016,9(430):ra56.

[15] Chalmin F, Mignot G, Bruchard M,etal. Stat3 and Gfi-1 transcription factors control Th17 cell immunosuppressive activity via the regulation of ectonucleotidase expression[J]. Immunity, 2012,36(3):362-373.

[16] Zhong SY, Chen YX, Fang M,etal. Low-dose levodopa protects nerve cells from oxidative stress and up-regulates expression of pCREB and CD39[J]. PLoS One, 2014,9(4):e95387.

[17] Cai XY, Li J,etal. Overexpression of CD39 and high tumoral CD39+/CD8+ratio are associated with adverse prognosis in resectable gastric cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol 2015,8(11):14757-14764.

[18] Cai XY, Ni XC, Yi Y,etal. Overexpression of CD39 in hepatocellular carcinoma is an independent indicator of poor outcome after radical resection[J]. Medicine (Baltimore), 2016,95(40):e4989.

[19] Cai XY, Wang XF, Li J,etal. High expression of CD39 in gastric cancer reduces patient outcome following radical resection[J]. Oncol Lett, 2016,12(5):4080-4086.

[20] Jackson SW, Hoshi T, Wu Y,etal. Disordered purinergic signaling inhibits pathological angiogenesis in cd39/Entpd1-null mice[J]. Am J Pathol, 2007,171(4):1395-1404.

[21] Sun X, Wu Y, Gao W,etal. CD39/ENTPD1 expression by CD4+Foxp3+ regulatory T cells promotes hepatic metastatic tumor growth in mice[J]. Gastroenterology, 2010,139(3):1030-1040.

[22] Kunzli BM, Bernlochner MI, Rath S,etal. Impact of CD39 and purinergic signalling on the growth and metastasis of colorectal cancer[J]. Purinergic Signal, 2011,7(2):231-241.

[23] 刘阳珷玥,杨 亭,赵 力,等.腺苷及其受体对中性粒细胞在炎症中的作用与机制研究进展[J].医学研究生学报,2014,27(11):1214-1218.

[24] Mantovani A, Biswas SK, Galdiero MR,etal. Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling[J]. J Pathol, 2013,229(2):176-185.

[25] Hasko G, Pacher P. Regulation of macrophage function by adenosine[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012,32(4):865-869.

[26] Sica A. Role of tumour-associated macrophages in cancer-related inflammation[J]. Exp Oncol, 2010,32(3):153-158.

[27] Zanin RF, Braganhol E, Bergamin LS,etal. Differential macrophage activation alters the expression profile of NTPDase and ecto-5'-nucleotidase[J]. PLoS One, 2012,7(2):e31205.

[28] Csoka B, Selmeczy Z, Koscso B,etal. Adenosine promotes alternative macrophage activation via A2A and A2B receptors[J]. FASEB J, 2012,26(1):376-386.

[29] Koszalka P, Golunska M, Urban A,etal. Specific Activation of A3, A2A and A1 Adenosine Receptors in CD73-Knockout Mice Affects B16F10 Melanoma Growth, Neovascularization, Angiogenesis and Macrophage Infiltration[J]. PLoS One, 2016,11(3):e0151420.

[30] Novitskiy SV, Ryzhov S, Zaynagetdinov R,etal. Adenosine receptors in regulation of dendritic cell differentiation and function[J]. Blood, 2008,112(5):1822-1831.

[31] Cekic C, Sag D, Li Y,etal. Adenosine A2B receptor blockade slows growth of bladder and breast tumors[J]. J Immunol, 2012,188(1):198-205.

[32] 毛晓明.医学研究生的新知识储备——组织内调节性T细胞的表型及功能[J].医学研究生学报,2017,30(4):337-341.

[33] Gu J, Ni X, Pan X,etal. Human CD39hi regulatory T cells present stronger stability and function under inflammatory conditions[J]. Cell Mol Immunol, 2017,14(6):521-528.

[34] Sundström P SH, Langenes V. Regulatory T Cells from Colon Cancer Patients Inhibit Effector T-cell Migration through an Adenosine-Dependent Mechanism.[J]. Cancer Immunol Res, 2016,4(3):183-193.

[35] Ma SR, Deng WW, Liu JF,etal. Blockade of adenosine A2A receptor enhances CD8+ T cells response and decreases regulatory T cells in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Mol Cancer, 2017,16(1):99.

[36] Lokshin A, Raskovalova T, Huang X,etal. Adenosine-mediated inhibition of the cytotoxic activity and cytokine production by activated natural killer cells[J]. Cancer Res, 2006,66(15):7758-7765.

[37] Hu G, Wu P, Cheng P,etal. Tumor-infiltrating CD39+gammadeltaTregs are novel immunosuppressive T cells in human colorectal cancer[J]. Oncoimmunology, 2017,6(2):e1277305.

[38] Smyth LA, Ratnasothy K, Tsang JY,etal. CD73 expression on extracellular vesicles derived from CD4+ CD25+ Foxp3+ T cells contributes to their regulatory function[J]. Eur J Immunol, 2013,43(9):2430-2440.

[39] Kinsey GR, Huang L, Jaworska K,etal. Autocrine adenosine signaling promotes regulatory T cell-mediated renal protection[J]. J Am Soc Nephrol, 2012,23(9):1528-1537.

[40] Shen L, Sundstedt A, Ciesielski M,etal. Tasquinimod modulates suppressive myeloid cells and enhances cancer immunotherapies in murine models[J]. Cancer Immunol Res, 2015,3(2):136-148.

[41] Beavis PA, Milenkovski N, Henderson MA,etal. Adenosine Receptor 2A Blockade Increases the Efficacy of Anti-PD-1 through Enhanced Antitumor T-cell Responses[J]. Cancer Immunol Res, 2015,3(5):506-517.

[42] Allard B, Pommey S, Smyth MJ,etal. Targeting CD73 enhances the antitumor activity of anti-PD-1 and anti-CTLA-4 mAbs[J]. Clin Cancer Res, 2013,19(20):5626-5635.