三七总皂苷对脑损伤模型大鼠神经行为学 损伤区VEGF及FGF表达影响的研究

张令春 褚延乐 王梦妮

1)河南省人民医院临床药学科，河南 郑州 450003 2)郑州大学第二附属医院药学部，河南 郑州 450014 3)郑州大学药学院，河南 郑州 450001

急性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是脑外科最常见的疾病之一。近些年来由于经济的飞速发展导致建筑意外、交通事故以及跌打损伤等引起的颅脑损伤也日渐增多。颅脑损伤患者的病死率极高，即使存活下来，也会给幸存者带来不同程度的残疾和心理问题[1]，这些问题会直接或影响其工作和社会行为，给患者的生活质量造成严重威胁，同时对这类患者的康复治疗照顾也会给社会带来沉重负担。因此，创伤性颅脑损伤救治的重大课题就是改善患者的生存质量，降低残疾和病死率。患者在受到创伤性颅脑损伤后会发生一系列复杂的生理病理变化[2-4]，除了暴力造成的急性的神经元及胶质细胞的直接损伤、血管破坏等机械性损伤以外，还包含由于微环境改变而导致的细胞因子改变从而触发的级联反应所引发的继发性损伤(包括缺血、缺氧、自由基损伤、离子失衡、炎症反应和细胞凋亡等)，这两种损伤结合引起 TBI患者脑微循环变化，引起患者脑细胞的生理功能的异常变化。因此，防止微循环障碍、促进损伤区微循环修复，是常用的治疗手段。但是，临床上传统的扩容及使用自由基清除剂、Ca+拮抗剂等治疗方法则效果欠佳。

三七在我国常常被用于治疗缺血性脑卒中，它具有消痛散瘀的作用。中药三七中最主要的化学成分是三七总皂苷(panax notoginseng saponins，PHS)，其主要作用是增加脑血流量，降低血黏度，抑制血小板聚集从而改善微循环[5]。因此，近年来三七总皂苷被广泛用于治疗心脑血管疾病。有研究表明，颅脑损伤后，应用三七总皂苷能够缓解脑水肿，改善血脑屏障的通透性，从而起到脑保护作用[6]。但是，目前对PNS治疗创伤性颅脑损伤的作用机制还不是特别清楚。本研究所采用大鼠创伤性颅脑损伤模型由自由落体法实现，采用PNS对模型进行干预，采用神经行为学评分对治疗结果进行评价，Western blot法检测大鼠海马区不同时间点的促血管生成因子VEGF及FGF表达的变化，探讨PNS修复创伤性颅脑损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料购买自河南省实验动物中心SPF级成年雌性Wistar大鼠60只，体质量为(200±5)g；注射用血塞通冻干针剂(PNS，规格：120 mg；昆明制药集团股份有限公司)；FGF抗体、VEGF抗体(Santa Cruz)。

1.2方法

1.2.1 TBI损伤模型制作：大鼠中度创伤性颅脑损伤模型采用 Feeney 自由落体硬膜外撞击法建立[7]。具体操作方法：采用10%水合氯醛对各组大鼠行腹腔注射(2 mL/kg)麻醉，头部备皮后将其固定于脑立体定向仪上，常规消毒和铺巾后，沿中线切开大鼠的头顶部皮肤，采用钝性分离对皮下组织进行分离，切开骨膜之后分离，并用牙科磨钻出骨窗，值得注意的是在操作过程中要尽量保证硬脑膜的完整性。具体操作方法：把撞击圆锥头端置于骨窗上，将砝码从距离骨窗35 cm的高处自由垂直落下，使之撞击硬膜上的圆锥，以形成中度脑损伤[8]。建模之后清理创伤面、止血，应用骨蜡将骨窗封闭，缝合。术后腹腔注射注射左氧氟沙星。对照组和治疗组在模型制作完毕后经腹腔分别注射 100 mg/mL生理盐水和此前制备好的PNS溶液100 mg/mL。在注射过程中，要密切注意大鼠的生理变化，术后需要单笼饲养。若实验过程中因操作和其他并发症引起死亡时，则去除该大鼠的所有实验数据，同时要注意补充新的大鼠，并记录其实验数据。将60只Wistar大鼠随机分为假手术组(切开头部皮肤，颅骨钻孔后不损伤脑组织不治疗)，治疗对照组(制作中度创伤性颅脑损伤模型成功后行腹腔注射生理盐水)及PNS治疗组(制作中度创伤性颅脑损伤模型成功后行腹腔注射PNS，剂量100 mg/kg)。见图1。

图1 动物模型制作：A大鼠脑损伤模型制作；B大鼠中度创伤性损伤后

1.2.2 神经行为学评分：大鼠麻醉苏醒后，单笼饲养，分别于损伤后的第3天和第7天的固定时间点从每组中取出10只大鼠，大鼠的神经运动感觉功能的系统评估主要采用改良的神经损伤程度评分量表(modified neurological severity scores，mNSS)来进行评估[9-11]。评分采用双盲法，具体操作方法：由熟知mNSS评分的2名不知情的实验员对各组大鼠的运动、感觉、平衡以及反射进行测试，并详细记录数据。评分表总分为0～18分，重度损伤为13～18，中度损伤为7～12分，轻度损伤为1～6分，正常大鼠的评分为0分。大鼠的神经功能采用运动、感觉、平衡4个方面来评价。

1.2.3 western blot检测：不同时间点损伤处组织VEGF及FGF表达变化，术后7 d将大鼠麻醉后固定于手术台上，无菌条件下分离脑组织，以损伤处为中心，截取大鼠脑组织约2 mm3，用预冷的生理盐水冲洗数次后置于冻存管中并快速存放于液氮中备用。RAPI裂解组织后12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清，BCA法测量蛋白浓度，后经聚丙烯酰胺凝胶电泳。转膜1.5 h，后置于50 g/L的脱脂奶粉溶液中室温封闭1 h，VEGF一抗(1：1 000稀释)、FGF一抗(1：800稀释)过夜孵育，用TBST溶液洗膜3次后于辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗溶液中室温下孵育2 h，TBST溶液洗膜3次，显影成像，最后用Image J软件进行蛋白灰度分析。

1.3统计学处理采用SPSS 19.0软件进行数据处理。采用重复测量数据的方差分析比较各组大鼠mNSS评分以及VEGF及FGF蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1大鼠神经损伤程度评分结果在模型大鼠进行治疗后的第3天特定时间点对各组大鼠进行 mNSS评分，结果显示，在PNS治疗后3 d内各手术组间差异不显著，且假手术组大鼠行为学表现正常；在治疗后第7天的同一时间点对各组大鼠进行 mNSS评分，对照组的评分则高于治疗组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠 mNSS 评分比较分)

2.2损伤组织中VEGF及FGF表达变化Western blot结果显示，术后7 d时对照组与治疗组中VEGF蛋白及FGF蛋白的表达均高于假手术组，与对照组相比较治疗组中VEGF的表达明显升高(P<0.05)。见图2、表2。

图2 SCI后28 d 各组大鼠脊髓组织蛋白表达比较

表2 TBI 7 d后VEGF、FGF蛋白在各组大鼠脑组织中的表达变化

注：与假手术组相比，*P<0.05；与对照组相比，#P<0.05

3 讨论

三七总皂苷是三七中的有效活性成分，具有活血化瘀，消肿止痛的功效。实验研究表明，三七皂苷能够保护心脑血管缺血缺氧损伤，且能够抑制脑神经细胞的凋亡[12-15]。

随着经济的高速发展，车祸和建筑意外导致的脑损伤数量不断增加[16-17]。由于引起脑损伤的创伤包含机械损伤外，还有继发性的脑损伤，二者都会引起脑损伤患者脑部微循环的变化。损伤的血管内皮细胞及其形态的变化可引起患者血管管壁组织结构的变化，进而导致局部血液流变出现变化，引起微循环障碍[18-20]，微循环障碍是局部微环境损伤的重要病理生理基础，也是影响患者神经恢复的重要因素。

VEGF在脑组织内有比较丰富的表达，还是生成血管的关键调节因子，特异地作用于血管内皮细胞，改善和帮助恢复损伤脑组织的血液供应，是效果最好的促血管生长因子之一。VEGF有强大的促进新生血管形成的能力，且能有效促进伤口的愈合[21-22]。VEGF也是目前挽救和治疗缺血性脑血管疾病和缺血半暗区脑组织功能损伤的关键所在。近些年对VEGF与中枢神经系统的诸如阿尔兹海默、帕金森等其他疾病之间的关系的研究也越来越多[23-24]，这足以看出VEGF具有巨大的应用前景。已有研究表明，PNS能够降低大鼠血小板聚集率，延长其颈总动脉血栓形成的时间，具有抗血栓作用[25]。本研究从神经行为学上证实，模型组大鼠经PNS治疗后神经行为获得较为明显的改善，为PNS向临床应用提供了一定的依据。治疗组大鼠颅脑损伤区域VEGF蛋白表达明显高于假手术组和对照组(P<0.001)，该研究表明PNS在一定程度上能够促进大鼠损伤脑区域的VEGF的表达。

FGF有促进新生血管形成、提高脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、增加脑血流量、抑制一氧化氮(NO)产生等功能，因此能够促进脑损伤患者的恢复[26-28]。本实验表明，PNS 治疗组大鼠损伤区FGF蛋白表达也明显高于假手术组和对照组(P<0.001)，说明PNS 能够促进大鼠损伤脑组织中FGF的表达。

综上，PNS可以增加颅脑损伤大鼠脑损伤区域VEGF及FGF的表达量。该研究不仅为PNS治疗颅脑损伤提供了科学的实验依据，也开拓了临床治疗颅脑损伤的新思路，也为以后进一步研究VEGF和FGF的脑保护机制提供了线索。

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