7种可食藻提取物对食品致病菌的抑菌效果

罗爱国， 冯　佳， 胡变芳， 吕俊平， 刘　琪， 谢树莲

(1.山西大学生命科学学院，山西太原 030006； 2.山西药科职业学院食品工程系，山西太原 030031；3.晋中学院生物科学与技术学院，山西晋中 030619)

随着世界经济的高速发展和人类生活水平的不断提高，食品安全越来越受到关注。全球食品安全事件的频发，给社会和人类造成了重大的安全问题与沉重的经济负担。在全球已报道的250多种食源性疾病中，食品致病菌引起的食物中毒事件约占到2/3[1]。同时在各类疾病发生率中，食源性疾病高居第二位[2]。我国仅在2007年到2013年间就有3 950起食源性疾病事件发生[3]。食品致病菌已成为食品安全控制必须面对的首要危害。

添加食品防腐剂是食品工业中解决食源性疾病及减少食品腐败变质的主要手段之一。然而化学合成防腐剂(如山梨酸、苯甲酸等)的使用，易引起致癌、致畸及食物中毒等问题[3]，使得天然防腐剂的开发利用受到人们的青睐。一些植物、动物、微生物资源因富含杀菌、抑菌活性物质而被关注，成为食品工业等研究的热点[4-9]。

藻类植物是一类具有光合作用、能够自养的低等生物。由于多变的生活环境和原始的进化地位，使其拥有许多结构独特的抑菌活性物质，如藻蓝蛋白、岩藻多糖、酚类、酯类、类胡萝卜素、卤化物及含硫化合物等[10-11]。自20世纪40年代开始，随着人们对藻类植物的抗菌活性成分不断研究，逐步认识到藻类是一类具有抑菌潜力的宝贵天然生物资源。一些研究者将藻类中的天然抗菌成分提取出来，应用于医药抗菌消炎、化妆洗浴用品及食品防腐保鲜等[10-17]，不仅可以较好地起到抗菌功效，同时还能减少对人类健康及环境的危害，更好地迎合消费者对绿色、安全的需求。另一方面藻类易培养，随着工业培养技术的发展，藻类进行规模生产已成为现实。因此，藻类作为天然抗菌剂的来源具有广阔的应用前景。

本研究对7种可食藻的活性成分进行了提取，测定了其水提物和醇提物对7种食品常见致病菌的抑菌圈直径及最小抑菌浓度(MIC)，以期为天然食品抑菌剂开发新资源提供参考资料。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1藻类地木耳(Nostoccommune)购于山西省汾阳市迅达土特产品有限责任公司，海白菜(Ulvapertusa)、海带(Laminariajaponica)、螺旋藻(Spirulinaplatensis)、裙带菜(Undariapinnatifida)、小球藻(Chlorellavulgaris)、坛紫菜(Porpyrahaitanensis)均购于山东滨州天健生物科技有限公司。藻类材料在室温下自然干燥15 d，经粉碎后过80目筛，得到藻粉，在4 ℃下贮藏备用。本试验实施时间为2016年7月至2017年5月。全部试验过程在山西大学生命科学学院实验室完成。

1.1.2受试菌种革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC 25923)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus，ATCC 14579)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，ATCC 19115)；革兰氏阴性菌：大肠杆菌(Escherichiacoli，ATCC 25922)、沙门氏菌(Salmonellaenterica，ATCC 13076)；真菌：白色念珠菌(Candidaalbicans，ATCC 10231)、黄曲霉(Aspergillusflavus，ATCC 26949)，均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2　方法

1.2.1水提物制备及其抑菌液的配制采用反复冻融法提取[18]。称取10 g藻粉，加入15 mL蒸馏水，置于冰箱中 -15 ℃ 保持30 min，取出后研磨，反复冷冻—研磨3次，加入无菌蒸馏水到200 mL，60 ℃水浴中提取1 h，后在7 500 r/min下离心5 min，收集上清液并真空浓缩至约20 mL，置冷冻干燥器内干燥，得到提取物，加蒸馏水定容到10 mL，制成浓度为1 g/mL的水提物原溶液，在4 ℃保存备用。以不加藻粉的提取剂经过相同的提取与处理作为对照。

1.2.2醇提物制备及其抑菌液的配制采用回流提取法。取10 g藻粉，加入200 mL 70%的乙醇，在75 ℃温度下回流提取2 h。醇提物经真空旋转蒸发(RE-52AA 型，上海亚荣生化仪器厂)浓缩至浸膏，加70%的乙醇定容到10 mL，制成浓度为1 g/mL的醇提物原溶液，在4 ℃保存备用。以不加藻粉的提取剂经过相同提取处理过程作为对照。

1.2.3菌悬液的制备(1)菌种活化：将菌种接入到事先备好的斜面试管(15 mm×150 mm)，置培养箱培养活化(细菌37 ℃ 24 h，真菌28 ℃ 48 h)。(2)菌悬液的配制：在无菌条件下，勾一环单菌落于50 mL新配制的相应培养基中进行培养(细菌37 ℃ 24 h，真菌28 ℃ 48 h)，制成菌悬原液。采用10倍稀释法将菌悬原液稀释至10-1～10-8倍的菌悬液，选取合适浓度的菌悬液涂平板，通过平板菌落计数法确定菌悬液浓度，并配制浓度为1×106CFU/mL的菌悬液备用。

1.2.4抑菌试验采用琼脂孔注入法[19]。取20 mL灭菌的培养基倒入培养皿制成平板，冷却10 min，吸取0.1 mL菌悬液均匀涂布于平皿表面，静置10 min，用直径为6 mm打孔器在平板表面打孔，每板3个孔(1个对照，2个平行处理)，分别加入80 μL无菌水或浓度为1.0 mg/mL藻提取液，将平皿置于生化培养箱培养。细菌在37 ℃培养24 h，真菌在28 ℃培养48 h后，采用直字交叉法测定抑菌圈直径，取平均值为作抑菌圈直径。试验在不同时间重复3次。

1.2.5藻类提取物最低抑菌浓度(MIC)的测定MIC的测定采用微量肉汤稀释法[20]。先在96孔细胞培养板加入 100 μL 灭菌的肉汤培养基，在第一列加入100 μL浓度为 0.4 g/mL 藻提取液，通过二倍稀释法稀释到第七列，从第七列弃去100 μL，再在每孔中加入100 μL菌悬液(106CFU/mL)，使抑菌液最终浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg/mL。第八列不加藻提取液和菌液，作空白对照，第九列为将藻提取液用相应的溶剂替代，作阴性对照，同时每列的下一行用灭菌的生理盐水替代菌液作为相应的吸光度校正组。将培养板置于生化培养箱培养(细菌为37 ℃培养12 h，真菌为28 ℃培养24 h)，后用肉眼观察各孔内澄清无菌生长，则为最低抑菌浓度，并在波长为595 nm处测定吸光度，当相邻两孔菌液的吸光度差异极显著(P<0.01)时，确定为MIC浓度(mg/mL)。试验重复3次。

2　结果与讨论

2.1　藻类水提物的抑菌效果

7种可食藻的水提物对常见食品致病菌的抑菌效果见表1。与对照组相比，螺旋藻水提物均表现出显著的抑制作用(P<0.05)，其抑菌性具有一定的广谱性，小球藻、海带及海白菜对3种革兰氏阳性菌(S.aureus、B.cereus和L.monocytogenes)和2种革兰氏阴性菌(E.coli和S.enterica)均有抑制作用(P<0.05)，但地木耳、裙带菜及坛紫菜的水提物对7种致病菌均无抑制作用(P>0.05)。对金黄色葡萄球菌(S.aureus)，4种藻的水提物具有显著抑制作用(P<0.05)，其抑菌活性顺序依次为螺旋藻>海白菜>海带>小球藻，其中螺旋藻作用最强，抑菌圈直径为13.83 mm。对蜡状芽孢杆菌(B.cereus)，4种藻的水提物具有显著抑菌作用(P<0.05)，其抑菌能力强弱依次为小球藻>螺旋藻>海白菜>海带，其中小球藻活性最强，抑菌圈直径为18.35 mm。对于单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)，4种藻的水提物具有显著抑菌作用(P<0.05)，其作用强弱依次为小球藻>螺旋藻>海白菜>海带，小球藻的作用最强，抑菌圈直径为9.32 mm。对于大肠杆菌(E.coli)，4种藻的水提物具有显著抑菌作用(P<0.05)，其作用强弱依次为螺旋藻>小球藻>海带=海白菜，其中螺旋藻作用最强，抑菌圈直径为 10.11 mm。对于沙门氏菌(S.enterica)，4种藻的水提物具有显著抑菌作用(P<0.05)，其活性强弱依次为螺旋藻>小球藻>海带>海白菜，其中螺旋藻的抑菌圈为9.16 mm。对于白色念珠菌(C.albicans)和黄曲霉(A.flavus)，只有螺旋藻水提物具有显著作用(P<0.05)，其抑菌圈直径分别为 6.54 mm 和19.58 mm。

表1　7种可食藻的水提物对食品致病菌的抑菌效果

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。表2同。

2.2　藻类醇提物的抑菌效果

7种可食藻的醇提物对常见食品致病菌的抑制效果见表2。与对照组相比，海带与螺旋藻醇提物表现出显著的抑制作用(P<0.05)，且对7种致病菌均有一定效果，海白菜对3种革兰氏阳性菌(S.aureus、B.cereus和L.monocytogenes)、2种革兰氏阴性菌(E.coli和S.enterica)及真菌黄曲霉(A.flavus)均有抑制作用(P<0.05)，但坛紫菜的醇提物对7种致病菌均无抑制作用(P>0.05)。对于金黄色葡萄球菌(S.aureus)和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)，除坛紫菜外，其他藻的醇提物均有显著抑菌作用(P<0.05)，其活性强弱顺序分别为螺旋藻>裙带菜=海白菜>海带>地木耳>小球藻、螺旋藻=海白菜>海带>裙带菜>地木耳=小球藻，其中作用最强的均为螺旋藻，抑菌圈直径分别为21.03 mm和18.37 mm。对于单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)，3种藻的醇提物具有显著抑菌作用(P<0.05)，其作用强弱依次为螺旋藻>海带>海白菜，其中螺旋藻的活性最强，其抑菌圈直径为 16.45 mm。对于大肠杆菌(E.coli)，4种藻的醇提物具有显著抑菌作用(P<0.05)，其作用强弱依次为螺旋藻>海带>海白菜=裙带菜，其中螺旋藻的作用最强，抑菌圈直径为 17.63 mm。对于沙门氏菌(S.enterica)，4种藻的提取物具有显著的抑菌作用(P<0.05)，其活性强弱依次为海白菜>螺旋藻>海带>小球藻，海白菜的抑菌圈直径为12.74 mm。对于白色念珠菌(C.albicans)，海带与螺旋藻的醇提物均有显著的抑菌作用(P<0.05)，抑菌圈直径分别为11.23 mm和 10.87 mm。对于黄曲霉(A.flavus)，3种藻的醇提物具有显著的抑菌作用(P<0.05)，其作用强弱依次为海带>螺旋藻=海白菜，海带抑菌圈直径为11.51 mm。

表2　7种可食藻的醇提取物对食品致病菌的抑菌效果

从7种可食藻的抑菌效果中，发现螺旋藻和海带提取物对食品致病菌的抑菌性较强，抑菌谱较广。有研究报道螺旋藻的甲醇提取物、正丁醇提取物及挥发性成分等对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及酵母菌有一定的抑制作用[21-23]。螺旋藻含有活性成分藻蓝蛋白，占到总蛋白的40%，而提取的藻蓝蛋白对S.aureus和E.coli均有抑制作用[24]。活性多糖在螺旋藻中占到8.3%[25]，浓度为20 mg/mL的螺旋藻多糖可有效抑制S.aureus、E.coli和Shigelladysenteriae(志贺痢疾杆菌)等[26]。海带中也含有大量活性成分，如多糖、多酚，具有一定的抑菌作用，其中多糖含量可达8.64%，能有效抑制S.aureus、E.coli、S.enterica和Enterococcusfaecalis(粪肠球菌)生长[27]，海带多酚也被证实对S.aureus、E.coli、VibrioParahemolyticus(副溶血性弧菌)和SarcinaLutea(藤黄八叠球菌)具有抑制作用[28]。螺旋藻与海带的提取物所表现出的抑菌作用与其成分中所含的活性物质如藻蓝蛋白、多糖、多酚等有关。

2.3　藻类提取物的最小抑菌浓度

根据藻提物的抑菌活性试验，对一种菌，每种溶剂选取1种抑菌活性较强的藻提物，测定其对相应菌株的最小抑菌浓度(MIC值)。可食藻提取物对3种革兰氏阳性菌的MIC值见图1。对于菌株S.aureus，螺旋藻水提物和醇提物的MIC值均为12.5 mg/mL。对于菌株B.cereus，小球藻水提物的MIC值为50 mg/mL，螺旋藻醇提物的MIC值为25 mg/mL。对于菌株L.monocytogenes，小球藻水提取物的MIC值>100 mg/mL，螺旋藻醇提物的MIC值为50 mg/mL。可食藻提取物对2种革兰氏阴性菌的MIC值见图2。对于菌株E.coli，螺旋藻水提物和醇提物的MIC值均>100 mg/mL。对于菌株S.enterica，螺旋藻水提物和海白菜醇提物的MIC值均>100 mg/mL。可食藻提取物对2种真菌的MIC值见图3。对于菌株C.albicans，螺旋藻水提物和海带醇提物的MIC值均>100 mg/mL。对于菌株A.flavus，螺旋藻水提物的MIC值为25 mg/mL，海带醇提物的MIC值>100 mg/mL。

在7种可食藻中，螺旋藻的抑菌活性最强，且对7种食品致病菌均有抑制作用，抑菌谱较广，其次是海带，再次是海白菜。从整体结果看，可食藻不论抑菌活性还是MIC值，其醇提物较水提物抑菌作用强，其原因可能有2个，一是醇作为溶剂与水相比，更能够有效破坏藻细胞，有效溶出活性成分，二是与藻类中抑菌活性成分的溶解性有关，抑菌成分大多是脂溶性的。藻类抑菌活性成分的提取、确定及抑菌机理需要进一步探索，以期最大限度地开发藻类资源作为抑菌剂。

3　结论

螺旋藻、小球藻、海带和海白菜的水提物表现出抑菌作用。对金黄色葡萄球菌(S.aureus)，抑菌效果依次为螺旋藻>海白菜>海带>小球藻，对枯草芽孢杆菌(B.cereus)，为小球藻>螺旋藻>海白菜>海带，对于单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)，为小球藻>螺旋藻>海白菜>海带，对于大肠杆菌(E.coli)为螺旋藻>小球藻>海带=海白菜，对于沙门氏菌(S.enterica)为螺旋藻>小球藻>海带>海白菜，对于白色念珠菌(C.albicans)和黄曲霉(A.flavus)，只有螺旋藻水提物具有显著效果(P<0.05)。

螺旋藻、小球藻、地木耳、海带、海白菜和裙带菜醇提物表现出抑菌作用。对于S.aureus和B.cereus，除坛紫菜外，其他藻的醇提物抑菌活性强弱顺序分别为螺旋藻>裙带菜=海白菜>海带>地木耳>小球藻、螺旋藻=海白菜>海带> 裙带菜>地木耳=小球藻。对于L.monocytogenes，抑用作用强弱依次为螺旋藻>海带>海白菜。对于E.coli，抑菌作用强弱依次为螺旋藻>海带>海白菜=裙带菜。对于S.enterica，抑菌活性强弱依次为海白菜>螺旋藻>海带>小球藻。对于C.albicans，海带和螺旋藻醇提物有显著抑菌作用(P<0.05)。对于A.flavus，抑菌作用强弱依次为海带>螺旋藻=海白菜。

对于S.aureus，螺旋藻水提物和醇提物的MIC值均为 12.5 mg/mL。对于B.cereus，小球藻水提物的MIC值为 50 mg/mL，螺旋藻醇提物的MIC值为25 mg/mL。对于L.monocytogenes，小球藻水提取物的MIC值>100 mg/mL，螺旋藻醇提物的MIC值为50 mg/mL。对于E.coli，螺旋藻水提物和醇提物的MIC值均>100 mg/mL。对于S.enterica，螺旋藻水提物和海白菜醇提物的MIC值均>100 mg/mL。对于菌株C.albicans，螺旋藻水提物和海带醇提物的MIC值均>100 mg/mL。对于A.flavus，螺旋藻水提物的MIC值为 25 mg/mL，海带醇提物的MIC值>100 mg/mL。

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