枇杷属若干野生种叶片愈伤组织诱导和再分化

刘义存， 黄天启， 林顺权

(1.仲恺农业工程学院，广东广州 510225； 2.华南农业大学园艺学院，广东广州 510642)

枇杷属(Eriobotrya)隶属于蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)，原产于我国南方地区以及与我国西南毗邻的东南亚几个国家，共约有30余个种或变种。我国的野生枇杷种数约占世界的2/3，但根据多年来的调查发现，野生枇杷资源正逐渐减少[1-4]。从20世纪80年代开始，我国就开始了一些关于枇杷叶片细胞工程及离体培养的研究，如原生质体培养[5-7]、胚乳愈伤组织诱导[8]、叶片培养和愈伤组织诱导不定芽[9-11]。虽然不断取得一些新进展，但迄今为止绝大多数报道都是关于栽培枇杷研究，而关于野生枇杷的叶片诱导愈伤组织、愈伤组织诱导再分化的系统研究还未见报道。为此，通过借鉴前人对普通枇杷叶片诱导愈伤组织的经验，将研究建立相对可靠而普适的野生枇杷叶片离体培养诱导愈伤组织和再分化技术体系，旨在为枇杷属栽培枇杷之外的各种枇杷种质资源离体保存、离体再生、细胞工程、转基因等研究提供技术支持。

1　材料与方法

1.1　材料

以枇杷属植物5个种、1个属间杂种为试材(表1)，所有材料均来自华南农业大学枇杷属种质资源圃。

1.2　方法

1.2.1叶片的接种从胚离体培养成功3个月后的试管苗中，以栎叶枇杷、台湾枇杷、台湾枇杷恒春变型、南亚枇杷窄叶变型、香花枇杷和石斑木×台湾枇杷等6个种的叶片为试材，在超净工作台上把无菌苗的叶片剪下来，切成约0.5 cm×0.5 cm 大小的叶块，叶背朝下，接种在胚培养基上。暗培养10 d，再转为24 h全光照，第20天统计愈伤率。随后对愈伤组织进行再分化研究。

表1　试验材料

1.2.2叶片的愈伤培养光照条件及不同生长调节剂对叶片诱导愈伤组织试验的培养基本配方为：MS+(0、0.2 mg/L)6-BA+(0、0.2 mg/L)KT+(0、1.0、3.0、6.0 mg/L)2，4-D(单位下同)，并做接种后全光照培养和接种后10 d暗培养的对比试验，选用材料为栎叶枇杷。

不同浓度2，4-D对4种枇杷属植物叶片诱导愈伤组织试验的培养基本配方：MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+(1.0、3.0、6.0 mg/L)2，4-D(单位下同)，并黑暗培养 10 d，选用材料为台湾枇杷、台湾枇杷恒春变型、南亚枇杷窄叶变型、香花枇杷。

枇杷属植物与近缘属植物交杂后代叶片诱导愈伤组织试验培养基配方：MS+1.0 mg/L 6-BA+(0、0.1 mg/L)NAA，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+(0.1、0.8 mg/L)TDZ，MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ，MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L ZT，MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 2IP，MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-D。选用材料为石斑木×台湾枇杷。

1.2.3叶片愈伤组织的再分化不同生长调节剂对诱导叶片愈伤组织植株再生及生根试验培养基配方：MS+1.0 mg/L 6-BA，MS+1.0 mg/L KT，MS+1.0 mg/L 2IP，MS+(1.0、2.0、3.0 mg/L)KT+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L 2，4-D，MS+(1.0，2.0、3.0 mg/L)ZT+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L 2，4-D，选用材料为台湾枇杷。

不同生长调节剂对枇杷属植物愈伤组织诱导胚状体及生根的试验培养基配方：MS+0.5 mg/L TDZ+(0、0.5、1.0 mg/L)KT，MS+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L TDZ+1.0 mg/L 6-BA。选用材料为栎叶枇杷。

以上试验设置不同的试验组合，每处理3个重复。培养环境条件：温度(18±1) ℃，相对湿度65%～70%。本试验数据用SPASS 11.0软件进行方差分析，采用邓肯氏新复极差测验法进行平均数比较。

2　结果与分析

2.1　若干种枇杷属植物叶片愈伤组织的诱导研究

2.1.1光照条件及不同生长调节剂对栎叶枇杷叶片诱导愈伤组织的影响研究发现，单独使用6-BA、KT、2，4-D的处理，栎叶枇杷叶片愈伤率都相对比较低；特别单独使用 2，4-D 的时候，愈伤率为0；而3种生长调节剂的组合处理愈伤率都比较高，差异显著。在不同光照条件的处理中，10 d 的暗培养效果明显，愈伤率平均达到57.78百分点，比全光照下的平均高17.78%。其中，0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-D组合经暗培养后，愈伤率达到100%，差异性显著(表2，图1-A1)。结果表明，随着2，4-D浓度的升高，愈伤率产生下降趋势，高浓度的2，4-D对栎叶枇杷叶片愈伤组织诱导有抑制作用。

表2　光照条件及不同生长调节剂对栎叶枇杷叶片诱导愈伤组织的影响

注：表中基本培养基为MS，植物生长调节剂的浓度单位为 mg/L。表中同列数值后不同字母表示0.05水平上差异显著。下表同。

2.1.2不同浓度2，4-D对几种枇杷属植物叶片诱导愈伤组织的影响为了进一步验证2，4-D的最适浓度，本试验再以4种枇杷属植物叶片(图1-B1)为试材，并黑暗培养 10 d。研究发现，随着2，4-D浓度的升高，愈伤组织的诱导率有下降的趋势。在2，4-D浓度为 1.0 mg/L 时，台湾枇杷(图1-B2)、台湾枇杷恒春变型和香花枇杷的愈伤率都达到100%；而南亚枇杷窄叶变型在所试的处理中愈伤率差异不显著；台湾枇杷愈伤率在所试的 2，4-D 浓度中均为100%(表3)。结合4个枇杷属植物叶片愈伤的生长情况及显著性分析，认为浓度为1.0、3.0 mg/L的2，4-D与6-BA、KT的组合配方适合枇杷属植物叶片愈伤组织的诱导。但通过愈伤组织的整体外观表现，浓度为 1.0 mg/L 的2，4-D愈伤组织更加有活力，与表2所得试验结论一致。

表3　不同浓度2，4-D对4种枇杷属植物叶片诱导愈伤组织的影响

注：每处理添加6-BA和KT浓度均为0.2 mg/L。

2.1.3枇杷属植物与近缘属植物交杂后代叶片诱导愈伤组织此次试验材料为石斑木×台湾枇杷杂交后代的叶片，因为石斑木属于蔷薇科苹果亚科，是枇杷属植物的近缘属植物，与野生台湾枇杷杂交的后代属于种质创新。结合表3的试验结果，进一步深化诱导的试验。研究发现，当单独使用6-BA时，无论是否加入生长素，石斑木×台湾枇杷叶片愈伤率都不高，分别为0、4.16%；当6-BA与TDZ组合使用时，愈伤率显著提高，并且随着TDZ的浓度从0.1 mg/L升至0.8 mg/L时， 愈伤率也从 45.83%提高到87.53%。浓度为 0.5 mg/L的TDZ、ZT和2IP，分别与0.1 mg/L NAA进行单独组合试验，试验统计得出TDZ愈伤率达到100%，ZT为 83.33%，2IP为91.67%，愈伤率差异不显著；而0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-D的组合愈伤率为90.52%，与0.5 mg/L TDZ差异不显著(表4)。结果表明，0.2 mg/L 6-BA、0.2 mg/L KT、1.0 mg/L 2，4-D的组合，对于无论是创新的杂交种，还是其他枇杷属植物而言，都比较适合作为叶片愈伤诱导的通用配方；此外，0.5 mg/L TDZ和0.1 mg/L NAA也可以成为石斑木×台湾枇杷杂交后代诱导愈伤组织的最佳组合。

表4　石斑木×台湾枇杷叶片诱导愈伤组织的结果

2.2　枇杷属2个野生种叶片愈伤组织诱导再分化

从以上试验成功诱导的叶片愈伤组织中取台湾枇杷和栎叶枇杷的愈伤组织作为胚状体诱导、分化芽苗和生根的试材。研究发现，在台湾枇杷叶片愈伤组织的诱导再分化试验中，虽然探索了各种各样的培养基配方，但均尚未获得成功，只能诱导部分愈伤组织分化生根，而不能分化芽苗(即地上部)。其中，1.0、2.0、3.0 mg/L KT与NAA、2，4-D的组合都能直接使叶片愈组织分化生根，生根率随着KT浓度的增加而增加，生根分化率最高达20%。而在ZT与NAA、2，4-D的组合中，只有2.0 mg/L ZT能诱导少数叶片愈组织分化生根，生根诱导率为8.33%(表5)。

研究还发现，在栎叶枇杷的愈伤组织诱导再分化试验中，产生了胚状体，同时少部分愈伤组织分化生根。添加TDZ都能使栎叶枇杷愈伤组织诱导出胚状体，但诱导率都比较低；KT比6-BA更适合愈伤组织诱导胚状体(图1-A2)。其中 0.5 mg/L KT和0.5 mg/L TDZ的组合使胚状体诱导率最高，达21.43%，这也是唯一同时能使愈伤分化产生根的组合(图1-A3 至图1-A5)，生根率为7.14%。

表5　不同生长调节剂对诱导台湾枇杷叶片愈伤组织植株再生及生根的影响

表6　不同生长调节剂对栎叶枇杷愈伤组织诱导胚状体及生根的影响

注：每处理添加NAA浓度圴为：0.1 mg/L。

3　讨论与结论

关于枇杷属植物野生种的研究报道，近10年来才慢慢地变得多些[1-3]，但还是不够，特别是野生种质资源在生物技术等方面的运用和开发[4，12-15]。枇杷属植物野生种的报道少，首先这些种质资源不多，收集难度大，即使收集到的种质资源，进行离体保存研究的也很少。可能由于野生种之间以及普通栽培种之间，在形态、生理和遗传等方面存在的差异，所以在研究过程度中，尽管借鉴前人在栽培枇杷细胞工程研究中的方法技术，但还是碰到了许多困难，例如，本研究表明，不同种之间结果差异性较大，从而导致本试验结果看起来不是很完整和统一。

在枇杷属植物野生种的叶片愈伤组织诱导的研究结果中，以1.0、3.0 mg/L 2，4-D与0.2 mg/L 6-BA、0.2 mg/L KT的组合配方，对香花枇杷、台湾枇杷、台湾枇杷恒春变型、栎叶枇杷、南亚枇杷窄叶变型和石斑木×台湾枇杷等6个种的叶片进行培养，诱导出愈伤组织，其中有5个种的愈伤诱导率达到了100%。经过大量试验验证枇杷属植物野生种的叶片诱导愈伤组织最佳的诱导条件为：在18 ℃下暗培养10 d后再转至全光照，培养基配方为MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-D。另外枇杷属植物与近缘属植物交杂后代叶片诱导愈伤组织的结果显示，属间杂种后代材料叶片愈伤的诱导既有其他枇杷属野生种的共性，也有本身的一些特性，如0.5 mg/L TDZ和0.1 mg/L NAA是诱导石斑木×台湾枇杷叶片愈伤组织的最佳组合之一。本试验还做了温度对枇杷愈伤组织诱导的试验，发现无论是温度18、22 ℃ 还是25 ℃，其愈伤诱导率差异性不显著，但 18 ℃ 下的试验愈伤组织的外观表现为黄绿色更有活力，容易扩繁，其他温度下的愈伤组织为青绿色、粉红色或白色，不容易扩繁。

在对枇杷属植物野生种叶片愈伤组织诱导再分化的试验中，虽然诱导出了胚状体和根，但诱导率不高，未能分化出完整芽苗或植株，培养条件还得继续试验优化。笔者也对其他野生种如台湾枇杷恒春变型、南亚枇杷窄叶变型、香花枇杷和石斑木×台湾枇杷同样做了愈伤组织诱导再分化的试验，但都未能成功，说明野生种枇杷的叶片愈伤组织比较难诱导再分化，还须要再做大量的试验进行探索研究。

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