Wnt1诱导分泌蛋白-1通过NF-κB通路促进食管鳞癌细胞的增殖和侵袭转移

凌锐，周玲，周月鹏，毛朝明，陈德玉

（江苏大学附属医院1.肿瘤研究中心，2.核医学科，江苏 镇江212001）

食管鳞癌易早期转移，预后较差，5年生存率仅为 20% ～40%［1－2］。我们早前实验证实［3］，食管鳞癌进程与异常活化的Wnt信号密切相关。Wnt信号通路中的关键调控因子Wnt1诱导分泌蛋白-1（Wnt1 induced secreted protein-1，WISP-1）通过αvβ3／FAK／c-Src、Ras和 NF-κB等信号通路，活化VEGF、MMP2及MMP9等蛋白表达，调控肿瘤的增殖、侵袭和转移进程［3－5］。本研究探讨在食管鳞癌中WISP-1表达与肿瘤细胞侵袭、转移能力获得之间的联系以及机制。

1　材料与方法

1.1　细胞、试剂与仪器

人食管癌Eca109、TE-8细胞株购于上海生物化学与细胞研究所细胞库；食管正常上皮细胞Het-1a购自广州吉妮欧生物科技有限公司。

RPMI-1640培养液和胎牛血清（Gibco公司）；兔抗人 MMP2、MMP9、VEGF-A、VEGF-C、WISP-1抗体（武汉博士德公司），鼠抗人β-肌动蛋白、HRP标记的 IgG、兔抗人 NF-κB、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα（Cell Signaling Technology公司）；脂质体 Lipo2000（上海英骏生物技术有限公司）；WISP-1 siRNA（上海吉玛制药技术有限公司）；Trizol试剂、反转录及荧光定量PCR试剂盒（大连TaKaRa公司）；WISP-1和GAPDH引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；细胞恒温培养箱（Thermo Fisher Scientific公司）；核酸测定仪 Biomate 3s及 Pierce ECL plus Substrate（Thermo Fisher Scientific公司）；Mx3000p实时定量PCR扩增仪（Stratagene公司）。

1.2　方法

1.2.1细胞培养 Eca109、TE-8和 Het-1a细胞株培养于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素混合液的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5%的CO2培养箱中，当细胞进入对数生长期再进行传代或者后续实验。

1.2.2荧光实时定量PCR检测WISP-1表达水平提取RNA后通过核酸测定仪确认其D（260 nm）／D（280 nm）在1.8～2.0之间，随后设置反应条件为37℃15 min，85℃5 s，进行反转录得cDNA。引物序列如下：WISP-1上游引物 5′-CTCAGCAGCTTGGGGACAAC-3′，下游引物 5′-GATGCCTCTGGCTGGTACAC-3′；GAPDH上游引物 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物 5′-TCCACCACCCTGTTGC TGTA-3′。反应条件：95℃2 min预变性；95℃15 s变性，60℃20 s退火／延伸，共40个循环。最终采用2－△△Ct法计算WISP-1的mRNA相对表达量。

1.2.3转染实验 转染前1天，接种5×105个细胞／孔至60 mm培养皿中，待细胞达到50%～70%后分别设置空白对照组、阴性对照组（空载体组）以及WISP-1 siRNA组。WISP-1 siRNA序列为5′-GACAUCCAUACACUCAUUATT-3′， 5′-UAAUGAGUG UAUGGAUGUCTT-3′；空载体序列为5′-UUCTCCGAACGUGCUCACGUTT-3′，5′-ACCUGACACGUUC GGAGAATT-3′。将1 mL Lipo2000混合不同siRNA或者等体积缓冲液加入预留的2 mL纯RPMI-1640培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育6 h。之后更换含有血清的普通培养基，分别转染24 h、48 h后提取RNA或者蛋白质以进行后续实验。

1.2.4流式细胞术检测WISP-1 siRNA处理后食管癌细胞株的凋亡取转染后Eca109和TE-8细胞，消化离心种于60 mm皿中，调整细胞密度为4.5×105个／皿。0.25%胰蛋白酶（不含 EDTA）消化、收集细胞，调整细胞密度为2.0×105个／管，先加入5 μL的Annexin V-FITC避光孵育15 min，上机前加入10μL的PI混合，每管加入400μL的PBS通过流式细胞术检测各组细胞的凋亡比例。

1.2.5CCK-8实验检测WISP-1 siRNA处理后细胞增殖能力 取转染后对数生长的食管鳞癌Eca109和TE-8细胞，消化离心后以6 000个／孔种入96孔板内，设定WISP-1 siRNA处理组、空白对照组和阴性对照组（每组5个复孔）。置于37℃、5%的CO2培养箱中孵育24 h、48 h和72 h，于每孔加入10μL的CCK-8溶液，在培养箱中培养1 h后，450 nm检测各组样品的光密度，并计算抑制率。

1.2.6Transwell实验检测 WISP-1 siRNA转染后细胞侵袭能力 用WISP-1 siRNA转染Eca109和TE-8细胞24 h后，消化离心重悬将2×105个细胞用无胎牛血清的培养基重悬接种在24孔板的Transwell（孔径为8μm）上室中，下室中加入10%胎牛血清的培养基。48 h后，将Transwell小室取出，用0.1%的结晶紫染色，显微镜下随机选取5个视野进行拍摄（200倍），统计每个视野的平均细胞数量。

1.2.7蛋白质印迹法检测细胞 WISP-1、MMP、VEGF及NF-κB相关蛋白 上述不同处理组的细胞于48 h后提取总蛋白，测定蛋白质浓度以确保每个加样孔中加入基本等量的总蛋白。电泳后将蛋白转至PVDF膜上，用5%BSA封闭 1 h，分别加MMP2抗体（1∶200）、MMP9抗体（1∶500）、VEGF-A抗体（1∶500）、VEGF-C抗体（1∶400）、WISP-1抗体（1∶400），β-肌动蛋白、NF-κB、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα均为1∶1 000，置于4℃中孵育过夜；TBST洗膜8 min×5次后，加HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。TBST再次洗膜8 min×5次，加入ECL化学发光显色液，于成像系统曝光并记录结果；相关实验至少重复3次。

1.2.8ELISA实验检测细胞培养上清液VEGF-C及MMP9的含量 分别收集空白对照组、阴性对照组和WISP-1 siRNA处理组Eca109和TE-8细胞培养上清液各2 mL，1 000 r／min离心 20 min，随后根据ELISA试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）操作说明，分别使用酶标仪在450 nm和490 nm处测量VEGF-C及MMP9的浓度。

1.3　统计学分析

应用SPSS 22.0软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　WISP-1在食管鳞癌细胞中的表达

实时定量PCR检测结果显示，与食管正常上皮细胞Het-1a比较，食管鳞癌Eca109及TE-8细胞中WISP-1的 mRNA显著上调（P＜0.05，图1），经WISP-1 siRNA干扰后，WISP-1的mRNA表达量明显下调（图2）。蛋白质印迹结果进一步验证了WISP-1蛋白表达的变化。

图1　W ISP-1在食管鳞癌细胞株中的表达

图2　荧光定量PCR和蛋白质印迹检测W ISP-1 siRNA干扰效果

2.2　下调WISP-1抑制食管鳞癌细胞的活性

流式细胞术检测结果显示，在食管鳞癌Eca109、TE-8细胞中下调WISP-1均未引起显著的凋亡率上升，与对照组相比无统计学意义（图3）；CCK8检测发现，下调WISP-1可显著抑制食管鳞癌细胞增殖活性（P＜0.05或 P＜0.01，图4）。

图3　流式细胞术检测食管癌细胞株早期凋亡结果

图4　CCK 8检测各组食管癌细胞增殖能力

2.3　下调WISP-1抑制食管鳞癌细胞的侵袭能力

Transwell实验显示，下调WISP-1可以显著地抑制Eca109和TE-8细胞的侵袭能力（P＜0.05，图5）。蛋白质印迹结果证实，下调WISP-1可明显抑制食管鳞癌细胞 VEGF-C、MMP9蛋白的表达，而VEGF-A和MMP2蛋白与对照组差异不明显（图6）；ELISA结果表明，下调 WISP-1后，Eca109、TE-8细胞培养上清液中的VEGF-C、MMP9外泌量较对照组出现了明显下降（P＜0.05，图7）。

图5　Transwell法检测各组食管癌细胞侵袭能力

图6　蛋白质印迹检测食管癌细胞中VEGF-A、VEGF-C、MMP2和MMP9的表达

2.4　下调WISP-1抑制NF-κB信号通路的活化

与空白对照组细胞相比，下调WISP-1表达均可以抑制食管鳞癌Eca109及TE-8细胞NF-κB-p65的磷酸化并促进 IκBα蛋白的磷酸化进程；对总的NF-κB-p65和 IκBα蛋白表达无明显影响（图8）。

3　讨论

在我国，食管癌以鳞状细胞癌为主，其发病率位居全部肿瘤类型的第5位。目前认为，食管鳞癌的发展多涉及部分关键信号通路的过度活化和MMPs、VEGF蛋白的异常表达，探讨食管鳞癌侵袭转移过程及其分子机制具有重要的临床意义。目前的研究主要集中在 Wnt、Notch、PI3K／Akt和 NF-κB通路，其中，NF-κB信号通路的异常活化与多种肿瘤发生、发展密切相关，例如调控包括细胞周期调节蛋白、VEGF、MMP2、MMP9等基因的表达，促进肿瘤细胞增殖、脉管新生、侵袭和转移，因此对影响NF-κB信号异常活化相关因素的研究显得十分必要［6－9］。

图7　酶联免疫吸附法测定各组食管癌细胞中VEGF-C、MMP9分泌量

图8　蛋白质印迹检测食管癌细胞NF-κB通路相关蛋白表达

近来研究发现，NF-κB信号通路存在着受其他通路的调控因子作用而活化的机制，从而形成复杂的共刺激信号网络，例如Wnt通路中的WISP-1［5］。WIPS-1属于结缔组织生长因子（CTGF）家族，参与许多细胞过程，包括增殖、分化、凋亡、迁移等。研究证实在口腔鳞状细胞癌［4］、前列腺癌［10］、骨肉瘤［5］等中均有WISP-1的高表达，并且其表达强度与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等存在着密切联系。

本研究证实，在食管鳞癌细胞中WISP-1蛋白的表达明显高于正常的食管上皮细胞；干扰Eca109和TE-8细胞的WISP-1表达后，抑制了食管鳞癌细胞持续增殖的能力，而对早期凋亡发生没有显著的影响。食管鳞癌组织中异常表达的WISP-1与淋巴结转移发生紧密相关［11－12］。本研究中，下调WISP-1后，Transwell实验结果证实食管鳞癌细胞的侵袭能力受到了显著抑制，同时与侵袭、淋巴管新生能力直接相关的MMP9和VEGF-C蛋白生成及外泌量均明显下降。蛋白质印迹结果显示，下调WISP-1表达可以抑制NF-κB-p65的磷酸化进程同时促进p-IκBα形成，进而阻止NF-κB信号的持续异常激活，初步证实了食管鳞癌中WISP-1可能参与NF-κB信号的活化。

综上所述，WISP-1可通过影响NF-κB通路活化，促进增殖、侵袭相关蛋白及因子的表达和分泌，在食管鳞癌信号通路共刺激调控、淋巴结转移发生等进程中发挥重要作用。

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