高效液相色谱法检测鸡蛋中氯霉素类药物残留

（广西兽药监察所，广西南宁 530001）

氯霉素类抗生素包括氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）和氟苯尼考（FF），具有广谱抗菌作用，抗菌谱包括需氧革兰性阴性菌及革兰性阳性菌、厌氧菌、立克次体属、螺旋体和衣原体属，在我国畜牧业中广泛应用，对畜禽的疾病控制和治疗起到了重要作用。但由于氯霉素对人、畜有严重的毒副作用[1]，能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病，许多国家已禁止在食用源性动物产品上使用。而作为其衍生物的甲砜霉素和氟苯尼考，由于毒副作用降低且具有较好的抗菌活性，价格也相对便宜，自氯霉素禁用以来是我国目前广泛应用的抗生素[2]。虽然甲砜霉素血液系统毒性比氯霉素小，抑制红细胞、白细胞和血小板程度比氯霉素轻，但免疫抑制作用比氯霉素强，仍有较强的毒副作用。氟苯尼考在结构上具有一定的优势，相对氯霉素和甲砜霉素，氟苯尼考具有毒性低，不引起动物再生障碍型贫血等特点，也没有“三致”作用（致畸、致癌和致突变），但繁殖毒性试验结果表明，氟苯尼考具有胚胎毒性[3]，用药后还会出现厌食、腹泻等不良反应。滥用甲砜霉素及氟苯尼考会引起的动物性食品残留，进而可能对人类健康产生危害，以及致病菌株耐药性的产生。

目前，有关氯霉素类药物残留的检测方法较多，主要采用液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法[4～12]等。本研究旨在建立一种灵敏、可靠的同时检测鸡蛋中氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考药物残留的高效液相色谱分析方法，方法定量准确，重现性好，基质加标实验表明，方法的准确度和精密度满足鸡蛋中药物残留检测的要求。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器：高效液相色谱仪（Waters公司，e2695/2998）；分析天平（METTLER TOLEDO公司，PB602-S）；高速冷冻离心机（SIGMA公司，3K15）；超声波水浴（昆山市超声仪器有限公司，KQ-250DB）；固相萃取装置（Waters公司）；氮气吹干仪（Organomation Associates公司，N-EVAP 116）；涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，QL-901）；旋转蒸发仪（BUCHI公司，R-200）；50ml鸡心瓶；50mL具塞塑料离心管；微孔滤膜（0.45μm）；HLB固相萃取柱（Waters公司，Oasis 6cc/200mg）。

主要试剂：乙腈为色谱纯；乙酸乙酯、正乙烷为优级纯；水为一级水；氯霉素（CAP）标准品，来源中国食品药品检定研究院，批号：130555-201203，含量99.8%；甲砜霉素（TAP）标准品，来源中国兽医药品监察所，批号：K0241406，含量99.7%；氟苯尼考（FF）标准品，来源中国兽医药品监察所，批号：K0301703，含量99.1%，用乙腈溶解配制成浓度为10.0mg/mL的标准储备液，临用时准确量取适量标准储备液用流动相稀释成适宜浓度的标准工作液。

1.2 样品处理

1.2.1 提取 取同一来源的10枚鸡蛋匀浆，使混合均匀。准确称取5.00g匀浆蛋样置于50ml具塞塑料离心管中，加入20ml乙酸乙酯，超声波提取5min，再涡旋提取5min后，以10000 r/min离心5min，吸取上清液于鸡心瓶中。再用20ml乙酸乙酯同样重复提取沉淀物1次。合并2次提取上清液，45℃旋转减压蒸发至近干。加入5ml10%甲醇水溶液至鸡心瓶超声5min使充分溶解，转移至50ml具塞塑料离心管中，再加入5ml10%甲醇水溶液至鸡心瓶中重复溶解沉积物1次并转移至同一离心管中。加入20ml正己烷至离心管中，涡旋5min后，8000 r/min离心2min，弃去上层正己烷，再用20ml正己烷重复以上操作，下层溶液待净化。

1.2.2 净化 用HLB固相萃取柱进行SPE净化，先后用甲醇、水各5ml预洗活化。取上述提取的水相过柱，用5ml10%甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，挤干，用5ml甲醇洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1.0 ml/min。洗脱液于45℃用氮气吹干，残留物用1.0ml流动相定容，涡旋混合1min，过0.45μm微孔滤膜后作为试样溶液，供HPLC测定。

同时作空白样品的处理，均按上述测定条件和步骤进行平行操作。

1.3 HPLC测定条件

色谱柱：XTerra®MS C18，5μm，250mm×4.6mm column；流动相：乙腈+水（1/5，V/V），使用前经微孔滤膜过滤，超声；流速：1.0 ml/min；柱温：室温；进样量：20μl；检测器：二极管阵列检测器，检测波长：CAP为280nm，TAP、FF为225nm。

1.4 添加回收率、检测限（LOD）和精密度的确定

取空白鸡蛋样品5.00g，加入一定体积的混标标准工作液，使在蛋样中的浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.10、0.20mg/kg；另取空白鸡蛋样品，不添加标准工作液。添加与空白均按上述样品前处理方法进行处理，作HPLC测定。再将相对应浓度的标准工作液作HPLC测定分析，计算各对应质量浓度的回收率。各空白鸡蛋样品测得基线噪音值，按信噪比S/N≥3为检测限。每个浓度点进行5个平行样品的测试，3次重复，根据色谱峰峰面积分别计算各浓度点的添加回收率、批内和批间变异系数。

2 结果与分析

2.1 样品提取剂的优化

氯霉素类药物属于弱极性物质，微溶于水，易溶于有机溶剂。常用于提取氯霉素类药物的有机溶剂有甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯[4～12]等，本研究选择甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯4种溶剂作为提取剂进行测定。结果表明，甲醇与蛋样中水分互溶，提取液中杂质较多，蒸干较慢；乙腈、丙酮是良好的蛋白沉淀剂，但在旋转蒸发时容易冒泡爆沸，蒸干时间长，影响效率；而乙酸乙酯作为提取剂提取率高，毒性小，而且容易蒸干，回收率稳定。本文采用乙酸乙酯作为提取液能最大限度提取出有效成分并使共萃取的干扰物较少，添加回收结果理想，回收率稳定。

2.2 样品净化条件的优化

由于采用乙酸乙酯作为提取溶剂，有大量脂质及类脂物质、组织内源性物质被提取出来，必须进行脱脂及去杂质处理。正乙烷是常见的脱脂溶剂，本研究采用正乙烷与10%甲醇水溶液之间进行液-液分配去除脂质及类脂质。液－液萃取后通常需用固相萃取柱进一步净化，HLB固相萃取柱为亲水亲脂平衡的水可浸润性的反相吸附剂，不影响吸附剂床的干涸，无须活化，直接上样，可对氯霉素类药物进行选择吸附，简化了实验步骤，有效去除了样品中的蛋白、磷脂、维生素和矿物质等基质干扰物，对蛋样基质能达到较好的净化效果。

2.3 固相萃取净化条件的优化

取1.0mL标准储备液添加到10mL纯水中，过HLB固相萃取柱，分别用5mL5%、10%、20%、40%、80%甲醇水溶液淋洗，取淋洗液直接进样检测。5%、10%淋洗液中均未检测到加标药物，20%淋洗液中检测到TAP药物，40%、80%淋洗液中均检测到TAP、FF、CAP药物。本研究采用10mL10%甲醇水溶液分两次溶解氯霉素类药物提取残留物，5mL10%甲醇水溶液淋洗，5mL纯甲醇洗脱。结果显示在本条件下能更充分溶解提取残留物中的待测物，使液-液分配过程分层明显，杂质干扰相对较少。

2.4 TAP、FF和CAP紫外吸收波长选择的优化

采用乙腈+水（1/5，V/V）为流动相，对氯霉素类药物进行二极管阵列波长扫描，结果见图1。

图1 TAP、FF和CAP二极管阵列检测器扫描光谱图

由图1可见，CAP最大吸收波长为280nm，TAP、FF最大吸收波长为225nm。

2.5 液相色谱检测

采用本试验中样品处理方法，在上述色谱条件下，标准溶液、空白样品和试样溶液的高效液相色谱图分别见图2、图3、图4。通过图谱分析可知，本法中TAP、FF和CAP出峰时间较稳定，干扰杂质较少。

图2 TAP、FF和CAP标准溶液色谱图（浓度为0.20mg/L）

图3 蛋样空白样品色谱图

图4 空白蛋样添加色谱图（添加浓度为0.04mg/kg）

2.6 线性范围、相关系数及检测限

在本方法确定的实验条件下，采用空白样品中添加标准工作液的方法制备标准工作曲线，TAP、FF和CAP添加浓度为0.02、0.04、0.08、0.10、0.20mg/kg，每个浓度点进行5个平行样品的实验，分别进样用平均值绘制标准曲线，获得的TAP、FF和CAP的线性方程、线性范围、相关系数及方法检测限（S/N≥3）见表1。

表1 TAP、FF和CAP的线性方程、线性范围、相关系数及方法检测限

2.7 方法的添加回收率和精密度

本研究建立的鸡蛋样品中氯霉素类药物残留检测方法，在20～200μg/kg添加浓度的平均回收率为69.45%～99.81%，其批内变异系数≤9.62%，批间变异系数≤14.28%。回收率和精密度结果见表2。

表2 样品回收率和精密度试验（n=5）

3 结论

该方法样品操作简单、灵敏度高、准确度和精密度好、检测数据准确可靠，达到残留分析的要求，可用于氯霉素类药物在鸡蛋中残留定量检测。但还存在定性不够准确的实际问题，今后研究的主要方向应为气相色谱-质谱（GC-MS）法和液-质联用（LC-MS或LC-MS/MS）法等能够定性的仲裁方法。

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