Au@4-硝基苯硫酚@Ag@牛血清白蛋白内标化表面增强拉曼散射探针的制备及其在细胞拉曼成像中的应用

翟学萍,　尤慧艳(1. 大连大学环境与化学工程学院, 辽宁 大连 116622; 2. 中国科学院烟台海岸带研究所, 山东 烟台 264003)

拉曼光谱成像技术具有灵敏度高、多元信号识别能力强等优势,近年来在分子检测、疾病诊断等领域受到了广泛关注[1]。研发拉曼信号强、光学性质稳定的表面增强拉曼散射(SERS)探针是实现拉曼成像的前提和基础。传统的SERS探针主要由金(Au)、银(Ag)等贵金属纳米粒子和其表面结合的拉曼报告分子两部分组成。贵金属纳米粒子为拉曼信号增强基底,报告分子则赋予SERS探针特征散射谱峰,二者的光学性质对SERS探针的信号强度具有决定性影响[2,3]。

内标化SERS探针是最近发展起来的一类新型纳米光学探针[4,5],其报告分子镶嵌于SERS探针结构内部[6,7],有别于传统SERS探针中报告分子吸附于贵金属纳米基底外层的结构。内标化SERS探针一般以金纳米球(AuNPs)或金纳米棒(AuNRs)为核心,在其表面修饰报告分子,进一步在复合物表面生长Au或Ag壳层,形成AuNP@Au[8-10]、AuNR@Ag[11-13]等核壳纳米结构。该设计不仅能显著提高信号强度,也可以提高探针在生物基质中的稳定性,避免报告分子解离和内源物质干扰所造成的信号变化[14]。此外,壳层贵金属的外表面裸露,可进一步吸附待测分子生成SERS信号,实现后续免标记传感[15-17]。

内标化探针的壳层种类对探针的性质具有重要影响。基于Au壳的内标化SERS探针生物相容性好[18],但其壳层厚度不易精确控制,灵敏度也较低;基于Ag壳的内标化探针虽然生物相容性较差,但其合成方法简单,壳层厚度可以精确调控[19]。而且Ag的拉曼增强能力优于Au,其信号灵敏度较Au壳包裹的探针高数十倍,在活体深层次检测中展示了更大的优势[20]。因此,基于银纳米材料探针的研发仍然是近年来的热点方向,值得注意的是,银层包覆内标化SERS探针一般在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)体系中合成,形成的探针表面会吸附CTAB，其细胞毒性较大[21],导致探针难以直接用于生物标记。此外,Ag壳层的化学性质较Au更为活泼,其氧化和溶解现象容易引起SERS探针的结构和信号变化[22-24]。

为了克服Ag壳内标化SERS探针的上述缺陷,发挥其高灵敏度的成像优势,本研究在合成以4-硝基苯硫酚(NT)为报告分子的Au@NT@Ag内标化SERS探针的基础上,进一步以牛血清白蛋白(BSA)置换探针表面的CTAB,发展了Au@NT@Ag@BSA内标化SERS探针。实验发现,Au@NT@Ag@BSA探针既保留了原探针的单分散性和高灵敏度,又显著提高了探针的信号稳定性和生物相容性。进一步将Au@NT@Ag@BSA探针和SMMC7721肺癌细胞共孵育,实现了细胞的探针标记和激光共聚焦显微拉曼光谱成像。研究表明,Au@NT@Ag@BSA内标化SERS探针在活体生物成像等方面展示了良好的应用潜力。

1　实验部分

1.1　仪器与试剂

s-4800扫描电子显微镜(日本Hitachi公司), RFS 100DXR激光共聚焦显微拉曼光谱仪、FT/IR-4100傅里叶变换红外光谱仪、2000/2000C紫外-可见分光光度计、FORMA STERI-CYCLE培养箱(美国Thermo Fisher公司), Nano-ZS90马尔文电位-粒度分析仪(英国Malvern公司), InfiniteM200全功能酶标仪(帝肯上海贸易有限公司), H1650-W台式微量高速离心机(湘仪仪器有限公司), KQ-250TDB超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司)。

氯金酸(HAuCl453H2O)、硝酸银(AgNO3)、硼氢化钠(NaBH4)、氢氧化钠(NaOH)和抗坏血酸(AA)均购自国药集团化学试剂有限公司,CTAB、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、NT、柠檬酸钠、二甲亚砜(DMSO)和氮蓝四唑盐(MTT)均购自阿拉丁试剂有限公司,BSA购自北京索莱宝科技有限公司,SMMC7721肺癌细胞购自中科院上海细胞库，DMEM培养基购自美国Hyclone公司,胎牛血清(灭活)购自美国Gibco公司,胰酶消化液、磷酸盐缓冲液(PBS)购自赛尔斯(中国)生物科技有限公司。

实验所用玻璃仪器均用新配制的王水HCl-HNO3(3∶1, v/v)清洗;实验所用的水均为二次纯化后的超纯水(18.2 MΩ5cm)。

1.2　AuNPs的制备

根据文献报道[25]采用种子生长法合成16 nm AuNPs。

种子的合成：将5 mL HAuCl4(0.5 mmol/L)和5 mL CTAB(200 mmol/L)混合搅拌均匀,向其中加入600 μL冰水配制的NaBH4溶液(10 mmol/L),搅拌,待溶液颜色由亮黄色变为棕色后停止搅拌,静置3 h。

金纳米球的合成:向2 mL CTAC(200 mmol/L)与1.5 mL AA(100 mmol/L)的混合溶液中加入20 μL种子,再加入2 mL HAuCl4溶液(0.5 mmol/L),于27 ℃搅拌15 min,得到16 nm AuNPs。

1.3　内标化Au@NT@Ag SERS探针的制备

取1 mL 16 nm AuNPs离心水洗2次(13 000 r/min, 15 min),弃去上清液,重新分散在1 mL去离子水中。向上述溶液中加入50 μL 1 mmol/L NT溶液,使NT报告分子的终浓度为0.05 mmol/L,超声15 min。然后取1 mL所得溶液加入200 μL CTAB溶液(200 mmol/L),以13 000 r/min离心15 min,弃去上清液,并用1 mL CTAB溶液(200 mmol/L)重新分散。所得溶液以13 000 r/min离心15 min,采用CTAB溶液(200 mmol/L)分散,重复此操作3次,最后分散在1 mL去离子水中,既得NT结合的金纳米球(Au@NT)。

进一步在Au@NT粒子表面包覆银层,借鉴文献[26]方法,分次加入不同体积的生长液。取1 mL Au@NT溶液,加入1 mL CTAB溶液(200 mmol/L),搅拌均匀,依次加入30 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L),然后用NaOH溶液(100 mmol/L)将反应体系的pH值调节至10,反应5 min，得到Au@NT@50Ag SERS探针。

另取一份Au@NT溶液采用上述相同的方法制得Au@NT@50Ag后,继续向其中依次加入20 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L),再用NaOH溶液调节反应体系的pH值至10,搅拌5 min后得到Au@NT@100Ag SERS探针。重复此操作,直至AgNO3溶液加入的体积达到300、500、700和1 000 μL,得到Au@NT@300Ag、Au@NT@500Ag、Au@NT@700Ag和Au@NT@1000Ag SERS探针。

1.4　外标化Au@Ag@NT探针的制备

取1 mL 16 nm AuNPs离心水洗2次(13 000 r/min, 15 min),弃去上清液,重新分散于1 mL去离子水中,向其中加入1mL CTAB(200 mmol/L)溶液,搅拌均匀,依次加入30 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L),然后用NaOH溶液(100 mmol/L)将反应体系的pH值调节至10,反应5 min，得到Au@50Ag纳米粒子。按照1.3节方法继续生长Ag层,得到Au@300Ag纳米粒子。离心水洗之后分散于950 μL去离子水中,加入50 μL 1 mmol/L的NT溶液,使NT报告分子的终浓度为0.05 mmol/L,超声15 min,然后加入200 μL CTAB(200 mmol/L)溶液,离心,弃去上清液,加入1 mL去离子水分散,备用。

1.5　Au@NT@Ag@BSA探针的制备

称取0.5 g BSA,溶于50 mL去离子水中,使BSA的终浓度为0.147 mmol/L,加入0.01 g柠檬酸钠,用NaOH溶液调节体系的pH值至7,备用。另外称取0.05 g BSA,溶于50 mL去离子水中,使BSA的终浓度为0.014 7 mmol/L,加入0.01 g柠檬酸钠,用NaOH溶液调节体系的pH值至12,备用。

取1.3节制备的Au@NT@700Ag SRES探针溶液1 mL,离心(5 800 r/min, 8 min),弃去上清液,分散于1 mL pH 7的去离子水中,将所得溶液逐滴加入3 mL pH 7的BSA溶液中,搅拌均匀,超声30 min,然后离心(5 800 r/min, 8 min),分散于1 mL pH 12的BSA溶液中,静置2 h,最后离心(5 800 r/min, 8 min),用pH 12的去离子水洗一次,分散于去离子水中并浓缩至500 mg/L。Au@NT@Ag@BSA SERS探针的合成过程见图1。

1.6　MTT比色法测SERS探针的细胞毒性

培养肺癌SMMC7721细胞至对数期,胰蛋白酶将其消化制成单细胞悬浮液,显微镜下计数,接种于96孔板,调节细胞含量为7×103个/孔,每孔加入200 μL细胞培养基,置于含5%(体积分数)CO2的细胞培养箱内,于37 ℃下培养24 h,使其贴壁。

培养24 h后,观察细胞生长状态。设置调零组、空白对照组和加样组,调零组不添加任何试剂,空白组加入20 μL灭菌水,加样组分别加入20 μL系列质量浓度(5、10、100和300 mg/L)的两种SERS探针(Au@NT@Ag与Au@NT@Ag@BSA)溶液,每个质量浓度设5个复孔,置于细胞培养箱内,于37 ℃培养24 h。

培养24 h后,每孔加入20 μL质量浓度为5 g/L的MTT溶液,放入培养箱中继续孵育4 h,弃去上清液,每孔加入200 μL DMSO,置于摇床上振摇10 min,直至结晶完全溶解,用酶标仪测定570 nm处的吸光度A570, 5个复孔取平均值。细胞存活率=A实验组/A对照组×100%。

1.7　细胞成像

培养SMMC7721细胞至对数期,胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,稀释后于显微镜下观察计数,于24孔板中调节细胞含量为1.2×104个/孔,每孔加入500 μL细胞培养基,于37 ℃细胞培养箱内培养12 h。培养12 h后,前12个孔分别加入100 μL Au@NT@Ag探针,后12个孔分别加入100 μL Au@NT@Ag@BSA SERS探针,使二者的质量浓度均为50 mg/L,共培养3 h后,用PBS清洗细胞两遍,置于玻璃片上密封,在拉曼显微镜下观察细胞形态,记录细胞不同区域的拉曼信号。

2　结果与讨论

2.1　Au@NT@Ag SERS探针的表征

对Au@NT@Ag SERS探针进行了理化性质和光学性质表征。采用冷场发射扫描电子显微镜测定,得到的结果显示,AuNPs的粒径约为16 nm,且分布均匀(见图2a)。Au@NT@Ag的冷场发射扫描电子显微镜结果显示,Au@NT@Ag近球形,且结构均匀,粒径大小约为60 nm(见图2b)。马尔文电位-粒度仪测试SERS探针结果显示,探针的水合粒径约为79 nm,平均Zeta电位为28.9 mV,表明探针表面吸附了阳离子表面活性剂CTAB。

采用紫外-可见分光光度计和激光共聚焦显微拉曼光谱仪对Ag层的生长过程进行监测。结果显示,随着AgNO3加入体积的增加,银层逐渐变厚,内标化SERS探针的紫外吸收峰显示了先蓝移后红移的过程,紫外吸收峰强度从0.18增加到1.17(见图3a)。图3b为加入不同AgNO3体积后制备的探针的激光共聚焦显微拉曼光谱图,可以看出报告分子NT在1 568、1 328和1 078 cm-1等处有特征峰。当AgNO3的加入体积从50 μL增加到700 μL时,SERS探针的拉曼信号逐渐增强,并在700 μL时达到最大。这是由于相较于Au纳米粒子,Ag层包裹后具有更好的拉曼增强效应[27]。当AgNO3的加入体积进一步增加到1 000 μL时拉曼信号出现降低趋势,可能是因为形成的Ag层过厚,对激发光的遮挡效应大于报告分子信号的增强效应,因此拉曼信号出现降低趋势[28]。因此选择Au@NT@700Ag作为SERS探针进行下一步研究。

图 3　AuNPs和加入不同体积AgNO3制备的Au@NT@Ag内标化SERS探针的(a)紫外吸收光谱图和(b)拉曼光谱图　Fig. 3　(a) UV absorption spectra and (b) Raman spectra of AuNPs and Au@NT@Ag tags by adding different volumes of AgNO3 solution Au@NT@50Ag, Au@NT@100Ag, Au@NT@300Ag, Au@NT@500Ag, Au@NT@700Ag and Au@NT@1000Ag were tags by adding 50, 100, 300, 500, 700 and 1000 μL of AgNO3 solution (10 mmol/L), respectively.

实验比较了内标化Au@NT@Ag和外标化Au@Ag@NT两种探针的信号强度。以AgNO3加入体积300 μL为例,外标化Au@Ag@NT探针在1 328 cm-1特征峰处信号强度约为220,内标化Au@NT@Ag探针的信号强度约为1 100,较前者显著提高。内标化探针的高灵敏度性质为后续成像应用奠定了基础。

2.2　Au@NT@Ag@BSA的表征

BSA生物相容性良好,并且分子结构中有二硫键和丰富的氨基、羧基等活性基团作为多价配体,具有比单价配体CTAB更强的金属结合力[29-32],因此尝试用其置换内标化Au@NT@Ag SERS探针表面的CTAB。首先将探针离心,用pH 7去离子水分散,使粒子表面CTAB浓度降至临界胶束浓度以下。然后采用pH 7和pH 12的BSA溶液各进行一次置换后,再用pH 12的去离子水清洗并浓缩至原浓度。

第一次置换过程中选择高浓度BSA是十分必要的,整个过程中高BSA-CTAB浓度比率有利于平衡向着BSA包覆纳米粒子的方向转移[33]。实验中将浓度为0.147 mmol/L的BSA与探针溶液按体积比1∶1和2∶1混合,探针会发生不同程度的团聚,探针粒子Zeta电位依然表现为CTAB的正电荷(35.5 mV和11.4 mV)。将二者体积比提高至3∶1,混合体系中粒子分散性良好,Zeta电位下降至BSA的负电位(-25.7 mV),表明粒子表面CTAB被BSA大量置换。第二次置换过程将BSA溶液的pH调节至12,主要原因是BSA等电点为4.8,在pH 12时呈现明显负电荷(约-35 mV)[30],有利于提高置换后粒子的单分散性。此外,游离态BSA易与带正电的CTAB通过静电结合作用形成复合物,便于在后续离心过程中将CTAB去除。

通过多种手段对置换过程进行验证。冷场发射扫描电子显微镜结果显示,BSA均匀包覆于Au@NT@Ag SERS探针表面且未造成纳米粒子团聚(见图4a)。水合粒径及电位分布测定结果显示,BSA置换使探针粒子的水合粒径由79 nm增大到88 nm,电位由28.9 mV转变为-25.7 mV。傅里叶变换红外光谱表明,BSA包覆的Au@NT@Ag粒子出现了1 450、1 392和1 245 cm-1等BSA的红外特征吸收峰(见图4b)。以上结果均表明BSA被成功包覆于内标化Au@NT@Ag SERS探针表面。

图 4　(a)Au@NT@Ag@BSA探针的扫描电子显微镜图和(b)BSA、Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探针的红外光谱图　Fig. 4　(a) SEM image of Au@NT@Ag@BSA tags and (b) FT-IR spectra of BSA, Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA tags

图 5　Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探针的(a)紫外吸收光谱图及实物图和(b)拉曼光谱图Fig. 5　(a) UV absorption spectra, photographs and (b) SERS spectra of Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA tags

进一步对BSA包覆的内标化SERS探针进行光谱性质表征。图5a显示,BSA包覆前后二者的紫外-可见吸收光谱的峰强度没有发生明显变化,包覆BSA探针的紫外峰形略微变宽且红移,这可能是由于纳米粒子界面折射系数发生了改变[34,35]。激光共聚焦显微拉曼光谱测定结果显示,BSA包覆过程未对探针的拉曼光谱强度及特征峰位造成明显改变(见图5b)。

2.3　SERS探针的稳定性和细胞毒性考察

图 6　Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探针30 d内的拉曼信号强度(n=3)Fig. 6　Raman intensity for the Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA tags within 30 d (n=3)

CTAB体系是Au@NT@Ag粒子中Ag层生长的必要条件,Au@NT@Ag粒子生成后表面包覆CTAB双层结构。在近中性条件下,Ag+/Ag、AgBr/Ag和O2/H2O的条件氧化还原电势分别为0.80、0.13和0.82 V,理论上讲,Br-的存在会促进溶解氧将银纳米粒子氧化溶解并最终形成AgBr。而BSA修饰的体系中,氧气和银层的接触概率较低,氧的条件氧化还原电位可能会低于0.80 V(Ag+/Ag)。溶解氧很难将银单质氧化溶解。为了验证这一假设采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪监测了Au@NT@Ag@BSA SERS探针30 d内1 328 cm-1处特征峰的信号强度,并以CTAB稳定的样品作对照。如图6所示,CTAB稳定的Au@NT@Ag探针拉曼信号持续下降,直至难以测出。由于BSA对Ag层的稳定和保护作用,Au@NT@Ag@BSA探针在30 d内显示了良好的稳定性。

图 7　与不同质量浓度的Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探针共培养24 h后SMMC7721细胞的存活率(n=5)　Fig. 7　Cell viability of SMMC7721 cells co-incubated with different mass concentrations of Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA SERS tags for 24 h (n=5)

进一步考察置换前后探针的细胞毒性。如图7所示,CTAB稳定的SERS探针Au@NT@Ag具有明显的毒性,细胞存活率随探针质量浓度的增加而迅速下降,在Au@NT@Ag探针的质量浓度为300 mg/L时细胞存活率已低于20%。BSA包覆后的SERS探针的细胞毒性明显降低,当Au@NT@Ag@BSA探针的质量浓度增加到300 mg/L时,细胞存活率仍维持在75%以上。上述结果表明,BSA置换可以有效消除Au@NT@Ag探针的急性毒性效应,但Ag壳的慢性毒性由于银离子缓释等原因难以避免。MTT比色法实验结果显示,在满足成像的Au@NT@Ag@BSA探针使用剂量下(50 mg/L),细胞保持了80%以上的存活率,结果令人满意。一定程度上解决了以往Au@Ag内标化SERS探针生物相容性差这一瓶颈问题,为后续活细胞成像应用提供了前提。

2.4　细胞拉曼成像结果

分别将Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA SERS探针与SMMC7721细胞共培养3 h,采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪50倍显微镜下观察细胞的生长状态及SERS探针分布情况,检测SERS探针的拉曼信号强度。观察结果表明,3 h后纳米粒子经吞噬作用进入细胞,如图8a显示,与Au@NT@Ag@BSA探针共同孵育的细胞状态良好,细胞内能够清晰地观察到大量的纳米粒子分布。比较而言,由于CTAB的细胞毒性效应,与Au@NT@Ag探针共培养后,细胞数目明显下降,且细胞内部探针颗粒较少(见图8b),表明该探针标记细胞的能力较弱。以上结果初步验证了Au@NT@Ag@BSA探针在成像分析中的适用性。

本研究通过反射光斑的大小,粗略估计细胞不同位置处粒子的数目差别,进一步将其和该处的拉曼信号强度进行比较,通过拉曼强度验证粒子分布的可行性和准确性。因此,进一步测定了单个细胞中不同位点的拉曼信号强度。如图9a所示,Au@NT@Ag@BSA SERS探针信号集中在细胞质区域,与明场照片(见图9a内插图)中颗粒出现部位呈现明显的对应;Au@NT@Ag探针在细胞中也显示相同的结果,但整体拉曼强度降低近一个数量级(见图9b)。与细胞共培养后采用激光共聚焦显微拉曼仪对3个细胞进行成像结果显示,Au@NT@Ag@BSA探针的摄取没有影响细胞的形貌和生长状态(见图9c),通过基于1 328 cm-1特征信号强度的拉曼成像图(见图9d)可知,BSA包覆的探针对细胞具有良好的整体成像效果。

3　结论

本研究设计合成了BSA包覆的内标化SERS探针Au@NT@Ag@BSA,该探针具有良好的信号稳定性和生物相容性。研究借助激光共聚焦显微拉曼光谱仪的采集和成像功能,实现了探针对SMMC7721肺癌细胞的定位和标记。研究结果表明,内标化Au@NT@Ag@BSA SERS探针在活体生物成像等方面展示了良好的应用潜力。

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