卵巢衰老的临床干预新进展

孙海翔，丁利军

(1. 南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心，南京 210008；2. 南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞研究中心，南京 210008)

自上世纪70年代以来女性寿命不断延长，但由于经济、社会等因素女性初次生育年龄升高，女性生育年龄高峰后移，生育力逐渐降低，随着年龄增加卵巢功能发生生理性衰退是其主要原因[1]。我国60%以上符合二孩政策的女性年龄在35岁以上，而这部分女性的基础卵泡储备和卵巢反应性急剧下降[2]。此外，约1%的育龄女性受到卵巢早衰(POF)疾病的困扰[3]。这些现象的出现使得卵巢衰老的研究和临床干预成为生殖医学领域的焦点之一。

一、卵巢储备及卵巢衰老

总卵巢储备(TOR)包括非生长卵泡(原始卵泡)和周期性募集的生长卵泡，后者又称之为功能性卵巢储备[4]。通常所指的卵巢储备特指功能性卵巢储备。在临床实际操作中，多以B超检测中直径2～10 mm的基础卵泡数反映功能性卵巢储备[5]。在既定范围内与年龄相符的功能性卵巢储备下降是正常的生理性卵巢衰老(NOA)。然而约10%的女性会出现与年龄不相符的功能性卵巢储备降低，因其没有显著的临床症状，称为隐匿性卵巢功能不全(OPOI)[4-6]。此外，约1%的女性会在40岁之前停经，功能性卵巢储备提前耗竭。针对这种疾病，欧洲人类生殖与胚胎协会(ESHRE)最近提出以早发性卵巢功能不全(POI)代替原有的POF概念。其推荐的POI诊断标准是：出现4个月以上的月经稀发或停经，FSH两次检测值高于25 U/L[7]。而原有POF的临床表现较POI更严重，表现为FSH>40 U/L并伴有超过4个月的继发性闭经[8]。ESHRE提出POI的新概念外延了POF的范围，体现出发达国家对卵巢衰老的关注和早诊断早干预的思路。我们认为，POF可被认为是POI中更严重的亚类，在我国生殖医学临床工作中仍具有疾病分类的意义。目前卵巢衰老的诊断主要指标包括：年龄、基础血清FSH、基础血清抑制素B、血清抗苗勒管激素(AMH)和基础窦卵泡数(AFC)，此外基础卵巢体积、基础血清E2、基础LH/FSH比值、卵巢间质血流等指标也受到关注[3]。AMH是由早期生长卵泡分泌的，其特异性反映功能性卵巢储备水平，且不依赖于月经周期，较为稳定。在40岁之前的卵巢衰老患者中，血清AMH值每年下降5.6%，窦卵泡(2～10 mm)计数每年下降4.4%，卵巢体积每年下降1.1%，成为预测卵巢储备的一个可靠指标[9]。

二、卵巢衰老的机制

诱发卵巢衰老的原因，包括遗传、DNA损伤修复、端粒、能量代谢、神经内分泌、卵巢微环境等因素。通过对POI患者进行全基因外显子测序分析发现FOXP3、FMR1、FIGLA、FOXL2、AIRE等基因的突变与POI的发生相关[10]。动物实验进一步证实PI3K/AKT/FoxO3通路的活化导致卵泡过度激活，成年小鼠出现POI表型[11]。脆性X智力迟缓基因1(FMR1)的RNA 5’ UTR区域的CGG重复与卵巢衰老程度呈现正相关，成为预测功能性卵巢储备的潜在指标[12]。卵母细胞和颗粒细胞内增加的DNA双链损伤和DNA修复缺陷，与卵巢衰老密切相关。抑癌基因BRCA1/2参与卵巢中的DNA双链损伤修复，BRCA1突变的小鼠和人都表现出卵泡提前耗竭[13]。衰老的端粒控制理论在分裂细胞中已经得到证实，近年来在小鼠卵母细胞衰老过程中也观察到端粒缩短、端粒酶活性降低和氧化应激损伤增加等现象[14]。卵母细胞的线粒体数量约为20～50万，线粒体DNA拷贝数超过百万，为卵母细胞提供能量。氧化应激引起的线粒体DNA突变增加，线粒体DNA突变的积累破坏线粒体的供能，造成卵母细胞的衰老，也是卵巢衰老的潜在机制[15]。下丘脑内侧基底区的神经干细胞控制机体的衰老，下丘脑的Kisspeptin神经元和GnRH神经元，调控下丘脑-神经-垂体轴。异常增高的Kisspeptin及其受体降低卵巢的卵泡储备，其突变与POF表型密切相关[16]。创伤、感染引起的卵巢纤维化，主要表现为间质部分胶原过度沉积和血供减少，可造成卵巢加速衰老和配子质量的下降[17]。这些因素都参与了卵巢衰老的调控，提示卵巢衰老的机制复杂性，需要进一步的深入研究。

三、改善NOA/OPOI患者临床结局的常规临床干预

荟萃分析显示对于卵巢衰老的患者，拮抗剂方案相较于长方案有类似的获卵数，而GnRH-a短方案虽然能获得更多的卵母细胞，但临床妊娠结局较长方案组、拮抗剂方案组没有显著差异[18]。对于功能性卵巢储备降低的患者，促排卵过程中增加FSH的剂量，并不增加获卵数，也不改善临床结局[19]。

灵长类动物中的研究显示，睾酮可以促进颗粒细胞上FSH受体的表达，并刺激早期卵泡的生长[20]。临床研究表明每天使用12.5 mg的经皮睾酮处理3周后再行控制性促排卵，有助于提高卵巢衰老患者的获卵数和活产率[20]。在卵巢衰老女性的IVF控制性促排卵周期前8周开始每天口服75 mg的脱氢表雄酮(DHEA)，临床妊娠结局得到了显著改善[21]。有研究进一步发现联合补充DHEA和辅酶Q10较单纯补充DHEA能增加卵巢储备，提高患者宫腔内人工授精(IUI)和IVF周期中的基础卵泡数，并降低IVF周期中促性腺激素的用量，但并不显著改善卵巢储备降低患者的临床妊娠率及活产率[22]。拮抗剂方案-ICSI周期中补充生长激素可以显著增加卵巢反应不良患者的临床获卵数、受精卵数和可移植胚胎数，但不显著改善临床妊娠率和活产率[23]。对于卵巢储备降低的患者，每天口服3 mg褪黑素至FSH启动日能显著提高获卵数及优质胚胎数，但临床妊娠结局尚无统计学差异[24]。甲状腺功能异常是育龄妇女最常见的自身免疫性内分泌紊乱疾病，有学者发现促甲状腺激素(TSH)≥3 μIU/ml不孕患者的AMH水平显著降低，提示甲状腺功能影响卵巢储备功能[25]。对于这部分卵巢储备降低的患者，补充甲状腺素可能提高其卵巢功能储备。

四、POI/POF临床干预新技术研究进展

(一)原始卵泡体外激活与卵巢组织移植改善POI患者临床结局

卵巢组织慢速冷冻及原位移植技术的成熟，以及卵巢组织玻璃化冷冻技术的兴起为生育力保存提供可行的方法，同时也使POI 患者卵巢组织的保存与体外处理成为可能[26]。在模式动物研究的基础上，对于POI患者卵巢中残存的卵泡，经过玻璃化冷冻结合丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)体外激活后可生成成熟卵母细胞，获得活产[27]。针对卵巢组织冷冻后卵泡存活率低的问题，新鲜组织体外激活直接移植后，14位POI患者中6位病人卵泡发育，IVF后获得优质胚胎，并且获得临床活产[28]。但是，AKT通路激活剂的临床安全性需要进一步验证。

(二)卵巢内干细胞移植恢复POF卵巢的卵泡发育

已经证实卵巢内存在两种干细胞：皮质下卵原干细胞和卵巢内间充质干细胞，对卵母细胞发生和卵泡发育至关重要[29-30]。干细胞包括胚胎干细胞(ESCs)、原始生殖细胞(PGCs)、间充质干细胞(MSCs)和卵源生殖干细胞(OGSCs)等，具有潜在的体外直接分化或体内修复卵巢功能的应用前景[31]。

近年来，卵泡穿刺获得上皮来源的潜在卵原干细胞可以在体外分化成为卵母细胞样细胞，表达卵母细胞特异性分子GDF9和ZP3，可能为POF患者体外卵母细胞发生带来新的素材，但是其临床应用仍需进一步研究[32]。卵巢内移植间充质干细胞恢复POF卵巢的卵泡发育，在POF模型动物中得到验证。脐带间充质干细胞移植到POF小鼠卵巢后定位于卵巢间质，旁分泌细胞因子肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素生长因子1(IGF-1)等，AMH水平显著升高，改善卵巢的卵泡发育和功能储备[33]。间充质干细胞复合支架材料，增加干细胞多种细胞因子的分泌，移植POF模型大鼠后提高卵泡发育和产仔数[34]。通过医院伦理委员会批准和国家卫计委干细胞临床研究备案后，本中心在国内率先进行POF合并不孕症患者脐带间充质干细胞移植干预的临床研究，14例POF患者入组后进行标准化的干细胞移植或干细胞联合胶原移植治疗。移植后3个月，干细胞组3例患者(3/6)和干细胞联合胶原组3例患者(3/8)卵巢体积和卵巢血流量显著增加[35]。根据Hoogland和Skouby的卵巢活动测量分类标准[36]，干细胞组1例患者(16.7%，1/6)和干细胞联合胶原组5例患者(62.5%，5/8)移植后显示卵泡活动，其中两例患者获得临床妊娠[35]，显示间充质干细胞联合支架材料移植对于改善POF卵巢功能具有良好的临床应用前景，但是仍然需要大样本、多中心临床研究加以验证。

(三)卵胞浆内线粒体移植提升衰老卵巢卵母细胞质量

卵母细胞能量代谢受损是造成衰老卵巢卵母细胞和胚胎质量降低的重要原因[37]。逆转卵母细胞衰老的方法包括胞浆置换、异体体细胞线粒体移植、自体体细胞线粒体移植，以及自体生殖系线粒体能量移植(AUGMENT)[37-41]。胞质移植明显改善了胚胎发育情况，临床获得妊娠及健康胎儿[38]。然而胞质移植缺乏动物模型的验证，移植成分复杂，线粒体基因异质性，造成 “三父母”伦理争议，2002年美国食品药品监督管理局(FDA)暂停相关临床研究[39]。而异体的体细胞线粒体移植临床效果不佳，也存在较大的伦理争议。自体卵丘颗粒细胞线粒体移植技术，显著改善卵母细胞质量，其受精率明显提高，优质胚胎率升高，已出生20名健康子代[40]。近年来，卵原干细胞作为新的线粒体来源，衍生出的AUGMENT技术明显提高受精率和优质胚胎率，显著增加临床妊娠率和活产率[41]。但是AUGMENT技术的临床治疗面临取材困难、有创，卵原干细胞分离、筛选、培养较难，价格昂贵，难以被病人接受等缺点，所以开展优质种子细胞选择和线粒体移植适应症的相关研究非常必要。

五、总结

伴随我国生育政策和女性生育愿望的变化，卵巢衰老患者临床诊疗需求增加；卵巢衰老包含NOA、OPOI和POI，其严重程度又可分级；卵巢衰老的诊断标准需要结合年龄、基础血清FSH、基础血清抑制素B、血清AMH和基础AFC等指标综合判断；卵巢衰老的机制复杂，原因多样，造成临床干预困难，结局不一；卵巢衰老的临床干预，需要针对病因，分层次、个体化诊疗，但目前尚无统一规范；卵巢衰老临床干预新技术的应用，应该遵循伦理保障、临床研究先行、患者及子代的安全为首要考虑等原则。

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