褪黑素增强盐害条件下水稻幼苗对稻瘟病的抗病能力

许秋怡，陈兆晖，季富宴，时浩杰

(浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江杭州 311300)

褪黑素是一种重要的植物生长调控剂，能促进植物抗病以及抗各种非生物胁迫[1-2]，可促进植物种子在逆境下发芽[1]，还可促进老化的种子恢复活力[3]。对于褪黑素具有的这些多重功能，其主要调控机理是因为它不但能直接清除活性氧，还能调控抗氧化酶基因表达[1-2]。此外，褪黑素还能调控植物抗病信号途径如水杨酸信号途径等[2]。

植物不同于动物，为了抵御来自于环境中的非生物胁迫(干旱、盐害、水涝、紫外线、重金属等)及生物胁迫(病原菌和虫害等)，它们在长期的进化过程中发展出一套精细、高效和完整的防卫系统[4]。在抵御非生物胁迫中，为消除活性氧自由基的毒害，所有有氧植物都进化出能清除这些毒害分子的抗氧化酶[如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POX)等]和抗氧化代谢物质[如类胡萝卜素、维生素C、维生素E、谷胱甘肽(GSH)等][5]。类似地，植物在抵抗病害过程中，同样有很多防卫酶[如多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等]和次生代谢物(酚类物质等)参与抵御反应[6]。当然，也有文献报道抗氧化酶在植物抗病过程中发挥一定作用[7]。在自然环境条件下，植物很少只面临单一的环境胁迫，往往几种胁迫因子同时出现[8-9]。例如，水涝条件下又面临着病害的出现，干旱条件下又面临着虫害的威胁。一般来讲，植物同时遭遇2种及2种以上较严重的环境胁迫时，后果是很严重的，往往导致植物死亡[8]。

水稻是我国南方和东北主要的农作物。在东北，水稻种植往往同时面临低温、盐碱以及病害等多重危害。其中，稻瘟病是一种危害极严重的病害[10]。这种真菌病害的发病严重程度除了与其生理小种致病力和水稻品种抗病力有关外，更与环境因素有密切关系。低温能导致水稻抗稻瘟病能力显著下降，而氮肥的过多施加也会导致其发病更严重[11-16]。目前对于作物应答单一胁迫的研究较多，对于多重胁迫的应答研究较少[8-9]。而盐害和病害都会诱导植物产生活性氧从而为害植物生长[17-18]。此外，一些保护酶如SOD、POX、PPO在植物抗病抗逆中发挥着重要作用[19]。鉴于此，笔者在生理水平上对盐胁迫条件下的水稻先喷洒褪黑素，然后接种稻瘟菌，观察了其抗病反应，以期为了解褪黑素对逆境下作物抗病的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料选取水稻品种中早39籼稻15日龄幼苗为植物材料。菌种为稻瘟菌ZB15，为国内标准鉴定生理小种。

1.2方法

1.2.1水稻幼苗培养。采用实验室水培方法。将发芽7 d左右(3叶期)的水稻幼苗从沙土中转移到塑料盆中(事先放置有钻孔的有机泡膜)，盆中加有1/10强度的Hoagland营养液。将全部塑料盆置于培养箱中，光照强度为250 μmol/(m2·s)，每天光照12 h。昼夜温度分别为30/20 ℃。待水稻苗适应性生长14 d后，清除生长不良的苗子，其他生长一致的健康苗子供处理用。

1.2.2菌种及其活化。参照董汉松[20]教授主编的《植病研究方法》，采用燕麦培养基培养稻瘟菌孢子。向平板中无污染的稻瘟菌菌落加适量灭菌后的蒸馏水，并置于光照下促进孢子生成。孢子使用前用蒸馏水洗下，稀释到1×106个/mL的浓度水平。为促进孢子更好地吸附到水稻叶片上，在孢子的稀释液中加0.02%吐温-20，混合均匀后，置于喷壶中，用于水稻叶片喷雾处理。

1.2.3接菌处理。将15日龄的水稻幼苗移到含有50 mmol/L NaCl的1/10强度Hoagland营养液中适应性培养4 d，对幼苗喷洒不同浓度(0、0.1和1.0 mmol/L)褪黑素，12 h后接种事先活化的稻瘟菌，再置于温室条件下(注意保湿)观察其发病情况。对照组为不含NaCl的营养液中接种稻瘟菌。

1.2.4保护酶活力检测。参照张蜀秋[21]主编的《植物生理学实验技术教程》上的实验方法，对不同时期(喷洒褪黑素后0、24和48 h)的叶片取样检测酶活力。SOD酶活力测定：收集200 mg水稻幼苗第3片叶，在预冷的研钵中加入2 mL PBS缓冲液(pH 7.0)，在冰块上研磨成匀浆，加入缓冲液至5 mL，在4 ℃下12 000 r/min离心30 min，上清液即为SOD抽提液，置于冰箱中保存待测。利用NBT法在560 nm处比色获取吸光值，每个酶活力单位定义为将NBT还原抑制到对照50%时所需的酶量。PPO酶活力测定：称取1 g水稻幼苗第3片叶组织，用5 mL 预冷的50 mmol/L PBS磷酸缓冲液(pH 7.8)研磨，再加入5 mL缓冲液洗下，倒入20 mL离心管中，4 ℃、14 000 r/min离心30 min，收集上清。所用反应体系为3 mL 200 mmol/L邻苯二酚(用pH 7.8磷酸缓冲液配制)、1 mL酶液，以灭活的酶液为空白对照，25 ℃水浴20 min，立即用20%三氯乙酸中止反应。在14 000 r/min下离心10 min，用分光光度计在495 nm处测定吸光度。1个酶活力单位定义为0.1个OD吸光度。

2 结果与分析

2.1在盐害条件下褪黑素增强对稻瘟病的抗病能力采用每株水稻苗上的平均病斑数评价抗病能力。病斑数越多表示抗病能力越弱，反之亦然。取5株幼苗在接菌后7、14和21 d病斑数的平均值。由图1可知，与对照相比，盐害显著降低了水稻对稻瘟病的抵抗力，7、14和21 d病斑数分别比对照增加了125%、145%和172%。然而，喷洒低浓度(0.1 mmol/L)和高浓度(1.0 mmol/L)褪黑素则显著增强了水稻在盐害条件下的抗病能力，第21天病斑数分别比盐害对照减少了27%和42%。这说明喷洒褪黑素能显著增强水稻幼苗在盐害条件下的抗稻瘟病的能力。

图1 盐害条件下喷洒褪黑素后水稻稻瘟病的发病情况Fig.1 The occurrence condition of rice blast under salt stress after spraying melatonin

2.2褪黑素增强保护酶活力水稻幼苗喷洒褪黑素后0、24和48 h取其第3片叶测定SOD和PPO活力。由图2可知，盐害显著降低了SOD活力。接菌后有轻微上升，然后喷洒低浓度褪黑素后，酶活力显著上升。喷洒褪黑素24和48 h后，相对于盐害+稻瘟菌组，盐害+稻瘟菌+褪黑素组的叶片酶活力分别上升了72%和92%。PPO活力趋势与SOD相同，喷洒褪黑素24和48 h后，相对于盐害+稻瘟菌组，盐害+稻瘟菌+褪黑素组的叶片PPO活力分别上升了38%和47%(图3)。

图2 喷洒褪黑素后水稻幼苗的SOD活力Fig.2 SOD activity of rice seedlings after spraying melatonin

图3 喷洒褪黑素后水稻幼苗的PPO活力Fig.3 PPO activity of rice seedlings after spraying melatonin

3 结论与讨论

植物在其生命周期中面临着三大任务：生长、防卫以及繁殖。在进入繁殖阶段以前的苗期阶段，生长和防卫是2个主要的任务[22]。一般来讲，当植物面临环境胁迫(非生物和生物胁迫)时，其生长会受到不同程度的抑制。这可能一方面与其光合作用受到抑制有关，另一方面也与其将更多的资源(如光合作用产物)转移投放到防卫物质合成而非生长上有关[23]。而当同时面临2种胁迫，如盐害和病害时，除不得不增加更多防卫物质合成外，还存在如何将这些资源合理分配到这两类不同性质的防卫物质的合成上的问题[23]。相对于单一胁迫，2种胁迫中的任何一种胁迫防卫能力都将相应被削弱。该研究也表明，盐害作为一种严重的非生物胁迫，会显著削弱水稻对病害的抵抗能力。这可能与降低相关保护酶(如SOD和PPO)活力有密切关系。SOD是最主要的活性氧清除酶，与植物抗逆境胁迫(如干旱、盐害等)有密切关系[5]，也与植物抗病有密切关系。PPO主要与植物抗病有密切关系。该酶通过参与催化多酚类物质和木质素的合成发挥抗病作用[7]。在该试验中，因为涉及到盐害和病害，所以选择这2个有典型代表性的指标作为主要研究对象。

褪黑素有多种调控作用，它既可以直接清除活性氧，减轻植物伤害，还能调控包括抗氧化酶在内相关基因的表达[1]。该研究中，将褪黑素喷洒幼苗后，能显著增强其对稻瘟菌的抵抗能力，对于其机理的探讨，着重从保护酶水平进行了研究，发现其能显著增强保护酶的活力。对于其促进这2个酶活力的机制，除了其自身能清除活性氧从而减轻活性氧对2种酶的伤害外[1]，可能也与其能从基因水平调控这2个酶的基因表达有密切关系[1]。事实上，褪黑素本身就具有调控抗氧化酶(如SOD、CAT等)活力的能力[1]，还能诱导水杨酸等信号途径[2]，而水杨酸信号途径的激活也会促进水稻抗稻瘟病[24]。今后需进一步从分子水平研究褪黑素对保护酶基因的调控机制，以及如何调控水杨酸信号途径从而发挥其在盐害条件下促进水稻抵抗稻瘟菌侵袭的能力。

综上得出以下结论：①盐害能显著降低水稻对稻瘟病的抵抗能力；②盐害也会降低SOD和PPO的活力；③褪黑素处理水稻幼苗，能增强其抗稻瘟病的能力，同时激活SOD和PPO的活力。

[1] ARNAO M B，HERNNDEZ-RUIZ J.Functions of melatonin in plants：A review[J].Journal of pineal research，2015，59(2)：133-150.

[2] LEE H Y，BYEON Y，BACK K.Melatonin as a signal molecule triggering defense responses against pathogen attack inArabidopsisand tobacco[J].Journal of pineal research，2014，57(3)：262-268.

[3] DENG B L，YANG K J，ZHANG Y F，et al.Can antioxidant’s reactive oxygen species(ROS)scavenging capacity contribute to aged seed recovery? Contrasting effect of melatonin，ascorbate and glutathione on germination ability of aged maize seeds[J].Free radical research，2017，51(9/10)：765-771.

[4] ATKINSON N J，URWIN P E.The interaction of plant biotic and abiotic stresses：From genes to the field[J].Journal of experimental botany，2012，63(10)：3523-3543.

[5] GILL S S，TUTEJA N.Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J].Plant physiology and biochemistry，2010，48(12)：909-930.

[6] DIXON R A，HARRISON M J，LAMB C J.Early events in the activation of plant defense responses[J].Annual review of phytopathology，1994，32(1)：479-501.

[7] 张树生，胡蕾，刘忠良，等.植物体内抗病相关酶与植物抗病性的关系[J].安徽农学通报，2006，12(13)：48-49.

[8] MITTLER R.Abiotic stress，the field environment and stress combination[J].Trends in plant science，2006，11(1)：15-19.

[9] DENG B L，YANG K J，ZHANG Y F，et al.Can heavy metal pollution defend seed germination against heat stress? Effect of heavy metals(Cu2+，Cd2+and Hg2+)on maize seed germination under high temperature[J].Environmental pollution，2016，216：46-52.

[10] HOWARD R J，VALENT B.Breaking and entering：Host penetration by the fungal rice blast pathogenMagnaporthegrisea[J].Annual reviews in microbiology，1996，50(1)：491-512.

[11] 赖星华，MARCHETTI M A.稻瘟病菌致病稳定性和温光环境条件对水稻抗性反应的影响[J].西南农业学报，1989，2(2)：43-48.

[12] 严红，徐宁彤，祝崇学.水稻稻瘟病与生态环境及施肥的关系[J].东北农业大学学报，1997(1)：23-28.

[13] 唐旭，郑毅，汤利，等.不同品种间作条件下的氮硅营养对水稻稻瘟病发生的影响[J].中国水稻科学，2006，20(6)：663-666.

[14] 赵颖，祖艳群，李元.UV-B辐射增强对水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)生长和产孢的影响[J].农业环境科学学报，2010，29(S1)：1-5.

[15] 杨丽敏.寒地水稻稻瘟病的发生与防治[J].中国稻米，2006，12(4)：43-44.

[16] 王东超，邢守佳.气候条件对水稻稻瘟病的影响与防治方法[J].吉林农业，2013(10)：20.

[17] DIONISIO-SESE M L，TOBITA S.Antioxidant responses of rice seedlings to salinity stress[J].Plant science，1998，135(1)：1-9.

[18] DE GARA L，DE PINTO M C，TOMMASI F.The antioxidant systems vis-à-vis reactive oxygen species during plant-pathogen interaction[J].Plant physiology and biochemistry，2003，41(10)：863-870.

[19] RAJ S N，SAROSH B R，SHETTY H S.Induction and accumulation of polyphenol oxidase activities as implicated in development of resistance against pearl millet downy mildew disease[J].Functional plant biology，2006，33(6)：563-571.

[20] 董汉松.植病研究方法[M].3版.北京：中国农业出版社，2012.

[21] 张蜀秋.植物生理学实验技术教程[M].北京：科学出版社，2001.

[22] BAZZAZ F A，CHIARIELLO N R，COLEY P D，et al.Allocating resources to reproduction and defense：New assessments of the costs and benefits of allocation patterns in plants are relating ecological roles to resource use[J].BioScience，1987，37(1)：58-67.

[23] MCLAUGHLIN S B，SHRINER D S.Allocation of resources to defense and repair[J].Plant disease，2012，5：407-431.

[24] JIANG C J，SHIMONO M，SUGANO S，et al.Abscisic acid interacts antagonistically with salicylic acid signaling pathway in rice-Magnaporthegriseainteraction[J].Molecular plant-microbe interactions，2010，23(6)：791-798.