废水资源化小球藻对拟南芥生长的肥效研究

杨方浩，侯利园，苑瑞东，程晓磊，黎滢静

(吉林大学，长春 130012)

过去的几十年间，我国化肥用量逐年递增，而肥料利用率却仅有30%～50%[1]，过剩的富营养元素随着农田排水或地表径流进入河流湖泊，对生态环境造成巨大威胁，使我国各大水系均面临不同程度的富营养化。为了加强养分资源综合管理、改善土壤质量、实现农业的可持续发展，配方肥、生物有机肥、新型肥料的开发等措施是满足粮食从高产高效到优质高产高效，再到提质增效转型升级的有效手段。

藻类污水生物处理技术最早是在1957年由Oswal等[2]提出，截至目前，挪威、日本已开展培养微藻进行环境保护研究[3]。我国微藻处理污水已经应用于生活污水、味精废水、养殖场废水、工业废水等相当广泛的行业中[4-7]。在众多微藻中，小球藻在无光异养条件下将废水中的铵态氮转化为细胞中的蛋白质、叶绿素等含氮物质，对氮、磷的最大吸收利用率达80%左右[8-9]，很多学者已将上述微藻深度脱氮除磷与扩大微藻生物量、制备藻类油脂等技术进行了耦合[10-12]。此外，藻类又因其具有固氮特性而被作为肥料施用于粮食、果蔬、花卉和草坪等作物上，达到促进种子萌发，提高产量，改善品质和土壤质量的目的[13-16]。然而，由于在利用过程中对蓝藻未经任何处理，一些产毒的水华蓝藻释放的毒素对农业生产具有潜在威胁，使其推广应用受到一定限制，因此，截至目前国内鲜有类似研究成果报道。笔者将微藻脱氮除磷与农业微藻肥料技术进行了耦合，以生长速度快、固氮吸磷能力强，且不分泌藻毒素的单细胞淡水微藻小球藻为供试藻株，开展废水-微藻体统中富营养元素富集效率及废水培养小球藻对拟南芥生长的影响，旨在为揭示富营养元素在废水-微藻-作物系统中的循环利用机理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1模拟浓缩污水的配置。根据北方污水成分特征，污水厂二级出水中氮、磷平均含量分别以50和5 mg/L计算，来配置10倍浓缩富营养化污水。结合微藻生长最适营养条件，微藻废水培养液具体成分及含量为：Tris base 2.42 g/L，NH4Cl 1.6 g/L，MgSO4·7H2O 100 mg/L，CaCl2·2H2O 50 mg/L，K3PO4112 mg/L，Na2EDTA·2H2O 50 mg/L，ZnSO4·7H2O 22 mg/L，H3BO311.4 mg/L，MnCl2·4H2O 5 mg/L，FeSO4·7H2O 5 mg/L， CoCl2·6H2O 1.6 mg/L，CuSO4·5H2O 1.6 mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1 mg/L，Acetic acid 1 mL/L；调整pH至7.0，于121 ℃高压灭菌20 min，冷却至室温待用。

1.1.2微藻的培养。蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidesa)，购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，采用TAP(Tris-Acetate-Phosphate)固态培养基进行藻种的保存，微藻的液态培养条件为：智能人工气候培养箱内25 ℃恒温振荡培养；光照强度3 000～6 000 LX；光照周期12 h∶12 h(光照∶黑暗)。小球藻生长曲线的测定：每天取微藻培养液2 mL，采用血球计数板法，显微镜下观察并计数小球藻的细胞浓度。

1.2方法

1.2.1废水中氨氮、全磷浓度的动态监测。每天从废水微藻混合体系中抽取水样，并过滤微藻，通过AA3连续流动分析仪对水样中剩余氨氮和全磷含量进行测定。

1.2.2拟南芥的盆栽试验。供试土样为贫营养土壤，采集自吉林省松原市，其基本理化性质为：全氮含量(1.13±0.14)g/kg，有效磷含量(12.43±1.56)mg/kg，有效钾含量(100.55±3.85)mg/kg，有机质含量(14.66±1.59)g/kg。以拟南芥为供试植物，进行微藻肥效试验，共设置4个处理：处理①，不施加任何肥料(CK)；处理②、③为浓缩废水培养后收集所得小球藻藻液，重悬于水溶液，含水率为95%左右，其中处理②藻液为鲜藻液，未经破碎处理，而处理③为超声波破碎藻液；处理④为2.0 g复合肥溶于500 mL水后的营养液。在拟南芥出苗后，每5 d用上述不同处理溶液浇灌1次，每次50 mL，测定不同生长期的拟南芥植株高度，并测定成株的根系长度，每处理重复3次。

1.2.3土壤酶活性的测定。对不同生长期的拟南芥进行根系周围土壤样本采样，每次处理采集6个土壤平行样本，其中3个样本进行含水率测定，对另外3个样本土壤中过转化酶和脲酶活性进行定量测定。土壤脲酶采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定；土壤蔗糖酶采用3，5-二硝基水杨酸比色法[17]测定。

2 结果与分析

2.1小球藻生长曲线的绘制从图1可见，蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidesa)在异养条件下繁殖速度较快，每6～8 h翻倍1次，在培养第4～6天达到最大生物量。在高氮、磷模拟污水条件下，该藻的生长并未受到抑制，最高生物量出现在培养第5天，此时小球藻的细胞浓度最高值约为3.3×107个/mL，随后进入生长稳定期。前期试验在无氮源条件下培养小球藻，结果几乎无生物量增长(待发表数据)，这验证了氮元素是小球藻生长的必须元素，外源氮的引入对小球藻的生长起到了促进作用。

图1 小球藻在高浓缩模拟污水条件下的生长曲线Fig.1 Growth curve of Chlorella pyrenoidesa in high concentrated wastewater

2.2小球藻对污水中氨氮的吸收率根据以上生长周期状况，对整个繁殖期小球藻吸收消耗氨氮的情况进行研究，结果见图2。从图2可见，随着培养时间的延长，小球藻的生物量不断积累，污水中氨氮浓度逐渐降低，并在培养后期达到吸附饱和状态，此时小球藻对高浓度含氮废水中氨氮的吸收去除率达到80%左右，表明小球藻对模拟污水中的氨氮有很强的去除能力，可用于实际污水中氨氮的去除，使污水经生物净化处理后可进行达标排放。

图2 氨氮含量随小球藻培养时间的变化趋势Fig.2 The variation trend of -N content with culture time

2.3小球藻对污水中磷的吸收率生活废水中的磷主要来源于人体排磷和生活洗涤排磷，磷作为微藻生长繁殖的营养元素，部分可直接被其吸收利用，然而，微藻对污水中磷元素的去除率远远低于对氮的去除效率。该试验设置了正磷酸盐含量为50 mg/L的模拟水样，对小球藻在高浓度含磷废水中的生长情况及含磷量进行动态监测，结果表明，随着培养时间的延长，小球藻不断增殖，模拟污水中的总磷含量呈递减趋势，当生物量达到最大值时，小球藻对磷的吸附趋于饱和状态，最大去除率为62.72%。普通生活污水中磷含量约在10 mg/L，小球藻对磷有较强的吸附能力，可以用于实际污水的生物净化处理，且处理后可达到磷达标排放的标准。

图3 全磷含量随小球藻培养时间的变化趋势Fig.3 The variation trend of TP content with culture time

2.4废水培养小球藻藻液肥对拟南芥植株生长的生物肥效对于微藻废水资源化的后续利用，近几年的研究工作主要集中于微藻的生物质能源的制备和生物肥料的应用2个方面[12，18-19]。该研究为了验证小球藻藻液的生物肥效，对拟南芥整个生长期的株高和根长进行了监测，结果见图4、5。从图4可以看出，拟南芥生长株高曲线呈“S”型增长趋势，在藻液肥施用20 d内，与CK相比，不同藻液处理对拟南芥的生长并无显著的肥效；而后随着生长期的延长，株高长势明显，各处理的株高从大到小依次为处理④、处理③、处理②、处理①(CK)；从图5可见，处理③小球藻藻液肥施用后，拟南芥平均根长比处理②的拟南芥平均根长要长出12.7%，其肥效更显著，说明破碎细胞对于营养物质的释放相较未破碎小球藻细胞更迅速。小球藻可利用水中铵态氮将其转化为细胞中的含氮化合物，参与代谢途径，经高浓度富营养污水培养后，小球藻体内累积了大量的氮磷营养盐，经破碎处理后，胞内基质得到彻底释放，对作物营养供给快，而未破碎小球藻藻液则通过活体代谢或死亡释放胞内养分，因此对植物供养较缓慢，且肥力较持久。

图4 不同处理藻液对拟南芥生长株高的影响Fig.4 Effects of different treatments of algae on the plant height growth of Arabidopsis thaliana

2.5小球藻藻液肥施用后对土壤酶活性的影响从图6可以看出，加入普通有机肥后土壤中脲酶活性的变化最大，达到200 μg左右，与CK相比，不同处理藻液肥对土壤脲酶活性均起到不同程度的激活作用；而对于土壤蔗糖酶活性，培养前5 d，各处理间蔗糖酶活性无显著差异，随时间的延长，肥料中的营养元素在土壤中逐渐释放，土壤蔗糖酶活性随之升高，且施肥处理略高于对照组酶活性，但藻液肥与有机肥处理间酶活性无显著性差异，培养15 d后，蔗糖酶活性随培养时间的延长呈下降趋势，由于蔗糖酶的活性与土壤有机碳、全氮含量有一定相关性[20]，因此，在培养后期，土壤中碳氮不断被消耗导致其含量下降，使蔗糖酶因失去底物而降低活性。

图5 不同处理藻液对拟南芥根长的影响Fig.5 Effects of different treatments of algae on the root length of Arabidopsis thaliana

图6 不同处理藻液对土壤酶活性的影响Fig.6 Effects of different treatments of algae on the activities of soil enzymes

3 讨论与结论

在对众多淡水微藻吸收氮、磷的能力的研究中发现，小球藻(Chlorellavulgaris)、栅藻(Scenedesmusobliquus)、衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的脱氮除磷能力相对较高[21]。该研究结果表明，小球藻对富营养污水的净化效果较显著，且对高浓度富营养污水氨氮的吸附去除率高于对磷盐的富集效率，在有氧条件下，硝酸盐、亚硝酸盐和铵盐可以用于小球藻代谢过程中氨基酸和蛋白质等物质的合成；磷酸盐可以直接被藻细胞吸收，并通过多种磷酸化途径转化成ATP和磷脂等有机物，使得藻细胞能同化污水中过剩的营养盐转化为自身的生物量，从而降低污水中的氮、磷含量。

我国北方富营养化污水的污染物成分相对较简单，主要以氮、磷营养元素及无机盐类为主，废水培养微藻可以进行有效资源的后续利用。该研究结果显示，废水资源化小球藻对作为生物藻液肥对拟南芥的生长具有一定促进作用，从废水中吸收固定的富营养元素以肥料的形式释放到土壤中，经过土壤微生物的作用，供植物生长利用，土壤脲酶活性的测定结果表明，藻液肥施用后土壤的氮素状况良好，拟南芥生长情况与氮肥释放效果有较强的一致性。基于富营养污水培养而得到的微藻之所以可被用作农业肥料，原因是一方面可以为农作物提供其生长所必须的氮、磷等营养元素，促使叶菜类、马铃薯等作物达到增产增收的效果，另一方面能够节约化肥施用量[19，22]。

国外学者对微藻废水资源化的后续利用研究较多，主要围绕废水培养微藻来制备生物质肥料。Wuang等[23]揭示了废水培养微藻所获取生物质可作为生物肥料促进小麦增收，且可节约土壤中25%的氮肥施用量；国内有关将微藻废水资源化与藻液肥在农业生产上的高值化利用相结合的报道较少。因此，未来的研究应将环境问题最小化和有限资源的合理回收利用更紧密地结合，为今后发展环境友好型节肥农业提供基础数据。

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