转EPSPS基因抗除草剂棉花在杂交制种中的应用初探

高明伟 王秀丽 张超 陈莹 姜辉 王家宝 柴启超 王永翠 赵军胜

摘要：以转EPSPS基因抗除草剂棉花种质为父本，以不具有除草剂抗性的普通陆地棉种质为母本，实施不去雄直接授粉配置杂交组合，并继而对其F1代杂交种苗期进行除草剂筛选鉴定，据此探讨出一种简化制种方法。SSR分子标记检测结果表明，该方法可以得到100%纯度的杂交种。该方法进一步改良后可以结合营养钵育苗在棉花杂交制种中推广，在简化制种技术上有重要利用价值。

关键词：棉花；EPSPS基因；除草剂；赤霉素；简化制种

中图分类号：S562.035.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）03-0029-04

Abstract In this paper， a simplified method of cotton hybrid seed production was discussed. The EPSPS transgenic cotton with herbicide resistance was used as the male parent， and the normal upland cotton germplasm was used as the female parent to carry out cotton seed production through direct pollination without castration， and then the F1 hybrids with herbicide resistance were screened out at seedling stage. The SSR molecular marker detection results showed that the simplified seed production method could produce 100% pure hybrids. This method can be further improved and popularize in the hybrid seed production of cotton with the combination of seedling nursing with nutrient bowl， which will have important utilization value in simplified seed production technology.

Keywords Cotton； EPSPS gene； Herbicide； Gibberellin； Simplified seed production

種植抗除草剂棉花可以扩大棉田杀草谱，使田间杂草防除变得简便易行，是降低除草成本、提高植棉效益的有效途径[1]。草甘膦（glyphosate） 是目前广泛应用的内吸型广谱性除草剂，它通过抑制植物体内芳香族氨基酸合成途径中的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的活性，阻断芳香族氨基酸的合成，从而杀灭杂草，对植物无选择性[2]。国内外科技工作者先后创制出转G6-EPSPS、CP4-EPSPS、GR79-EPSPS等基因的抗除草剂棉花种质[4-6]，为培育具有我国自主知识产权的抗草甘膦棉花品种奠定了基础。研究表明特定浓度的草甘膦可以诱导转EPSPS基因棉花产生雄性不育，因此在棉花育种及杂交制种中研究较多，可用于简化制种[7-11]。然而此前的研究均是以抗除草剂棉花作为母本进行简化制种，但抗除草剂棉花只作母本也限制了杂种优势的充分利用。本研究拟初步探讨一种以转EPSPS基因棉花种质作父本进行简化制种的方法，为抗草甘膦棉花育种应用以及商业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

抗除草剂棉花品系R02及R118：利用引自浙江大学以中棉所49为受体的转G6-EPSPS基因的原始抗除草剂材料，与本课题组自育材料回交转育而成。

非抗草甘膦品系为G35：本课题组自育材料。

除草剂：41%农达（孟山都公司生产的草甘膦）。

1.2 试验方法

1.2.1 组合配制 2016年将R02、R118和G35种植于山东棉花研究中心临清试验站，管理措施同大田。共有两组杂交组合，组合1为G35×R02，组合2为G35×R118。

母本处理方式分为两种，即处理A为对照，不喷施赤霉素；处理B为现蕾后15 d，用浓度为100 mg/kg的赤霉素整株均匀喷施，此后每隔10 d喷施同等浓度赤霉素1次，共喷3次。试验用赤霉素为Sigma公司生产的分析纯G7645。

母本开花后不去雄，用父本直接进行人工授粉，并在盛花期调查母本两个处理下连续20棵棉花的柱头长度。

1.2.2 杂种田间除草剂筛选鉴定 2017年将亲本R02、R118和G35及上年度获得的4组杂交种种植于山东棉花研究中心临清试验站，每个材料种植3行，面积为20 m2。

在苗期选择晴朗天气用100倍41%农达除草剂喷施叶片，3 d后观察表型。G35与非抗单株叶片边缘皱缩枯萎，R02、R118与抗性单株叶片无变化。对表型进行统计，杂种中抗性单株标记为真杂种。

1.2.3 杂种室内分子鉴定 提取全部抗性单株及亲本DNA，利用棉花基因组SSR标记对杂交种真伪性进行分子鉴定。棉花基因组DNA提取采用简化的CTAB法[12]，DNA用1×TE溶解，稀释到50 ng/μL备用。选择多态性好的核心引物用于杂交种分子鉴定[13-15]，SSR标记序列来自棉花标记公共数据库CMD（http：//www.cottonmarker.org/），引物由上海铂尚生物科技有限公司合成。

PCR扩增在ABI9700PCR仪上进行，体系为20 μL，包括2×EasyPCR mix 10 μL，DNA模板1μL，ddH2O 9 μL。反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，30循环；72℃延伸10 min。PCR产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，银染后[16]用凝胶成像系统记录电泳分离结果。

1.3 数据处理

数据采用DPS软件处理，用t检验法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 赤霉素处理后柱头伸长效果

如图1所示，经赤霉素喷施诱导后，母本G35柱头明显伸长。未进行赤霉素诱导的处理A的柱头平均长度为0.05 cm，而处理B的柱头长度平均为1.03 cm，柱头平均伸长近1.0 cm，差异达到极显著水平（表1）。

2.2 制种纯度的田间鉴定

抗除草剂单株和非抗单株对41%农达的敏感性明显不同，喷施农达3 d后，非抗单株生长明显被抑制，叶片边缘皱缩，局部出现坏死斑，而抗性单株生长正常（图2）。根据叶片对农达的反应程度对各处理组合制种纯度进行田间鉴定，结果如表2所示：不喷施赤霉素情况下，组合1的田间鉴定纯度为36.09%，组合2的田间鉴定纯度为37.32%，平均纯度为36.71%；赤霉素诱导后，组合1的田间鉴定纯度为43.40%，组合2的田间鉴定纯度为48.31%，平均纯度为45.86%。这说明赤霉素诱导后柱头伸长，在一定程度上降低了棉花自交率，但是在本研究中差异不显著，效果不理想。

2.3 杂种纯度分子鉴定

用棉花基因组SSR标记对具有除草剂抗性的杂种植株做进一步分子鉴定，以明确其是否为真杂种。选取多态性较好的256对SSR引物对3个亲本进行差异筛选，共获得9个差异共显性标记（表3）。

对组合1、组合2的F1存活单株分别进行SSR检测，结果显示存活的单株均为真杂种，纯度为100%。图3、图4分别为用CGR5732 和NAU1221标记筛选部分F1单株的结果。

3 讨论与结论

杂种优势利用是提高棉花产量的有效途径之一。利用不育系和人工去雄是目前生产杂交种的主要方式，但是不育系制种在很大程度上限制了亲本选配，而人工去雄费工费时、成本高，因此探讨不去雄直接授粉的简化制种为解决杂交制种难题提供了可能。本研究初步探讨了以转EPSPS棉花种质为父本的简化制种方法。本试验还尝试对母本进行赤霉素诱导，结果处理后柱头伸长，在一定程度上降低了自交结实率，制种纯度高于未经赤霉素处理的对照，但效果并不理想。张银虎[17]对sGK321进行赤霉素诱导处理，优化结果显示浓度在100 mg/kg时制种产量及纯度能达到理想水平。本研究未能达到同样水平，可能是与所用的母本基因型不同有關，因此下一步有必要针对母本G35进行赤霉素诱导最适浓度的探讨。

本简化制种方法以非抗除草剂材料作母本，抗除草剂材料作父本，制种所得种子经过田间除草剂筛选处理及分子标记检测，存活植株全部为真杂交种，说明这种简化制种方式在生产上具有可行性。浸种是农业生产上常用的种子处理技术，具有易操作、高效、低成本的特点，有研究表明利用草甘膦浸种法鉴定转基因抗草甘膦棉花是可行的[18，19]，可以对本简化制种方法获得的种子进行草甘膦浸种，有效去除母本自交株。考虑到杂交种生产上多用营养钵育苗移栽的方式[20，21]，也可以对苗床用草甘膦预处理，保证大田使用的杂交种的高纯度。因此，该方法进一步优化后可应用于棉花杂交种子的生产，以达到简化制种省工的目的。

参 考 文 献：

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