聚六亚甲基双胍盐酸盐与氟环唑对水稻稻曲病菌的联合毒力测定

吴斌 姜珊珊 张眉 徐德坤 王升吉 辛相启

摘要：本研究采用菌丝生长速率法测定了聚六亚甲基双胍盐酸盐（polyhexamethylene biguanidine hydrochloride）与氟环唑（epoxiconazole）混配对水稻稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）的毒力，旨在明确二者混配对水稻稻曲病菌的联合作用类型及最佳配比。结果表明，聚六亚甲基双胍盐酸盐、氟环唑对水稻稻曲病菌的EC50分别为44.111、1.743 mg·L-1，氟环唑对水稻稻曲病菌的室内毒力活性明显高于聚六亚甲基双胍盐酸盐。聚六亚甲基双胍盐酸盐与氟环唑25∶1配比表现为相加作用；5∶1、10∶1、15∶1和20∶1四个配比表现为增效作用，其中，配比为10∶1和15∶1的SR分别为1.64和1.66，增效作用明显。

关键词：聚六亚甲基双胍盐酸盐；氟环唑；水稻稻曲病菌；联合毒力；增效作用

中图分类号：S435.111.4+9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）02-0108-04

Abstract This study was conducted to clarify the co-effects of mixed polyhexamethylene biguanidine hydrochloride （PHMB） and epoxiconazole on Ustilaginoidea virens， and to find out their best mixed ratio by mycelium growth rate method.The results showed that the EC50 of PHMB and epoxiconazole to U. virens were 44.111 and 1.743 mg·L-1， respectively， which indicated that the indoor toxicity of epoxiconazole to U. virens was more active compared with PHMB. In the 5 different mixing ratios of PHMB and epoxiconazole， the ratio of 25∶1 could do additively， and the ratio of 5∶1， 10∶1， 15∶1 and 20∶1 had synergistic effect on U. virens； among which， the ratio of 10∶1 and 15∶1 showed the strongest synergistic effect with the synergistic coefficients as 1.64 and 1.66， respectively.

Keywords Polyhexamethylene biguanidine hydrochloride （PHMB）； Epoxiconazole； Ustilaginoidea virens； Combined toxicity； Synergistic effect

水稻稻曲病是由稻綠核菌[Ustilaginoidea virens（Cooke） Tak.]引起的一种水稻穗期病害，可导致水稻结实率显著下降、品质降低，一般可减产3%～5%，严重时达 8.7%～45.7%[1，2]。另外，稻曲病菌还能产生一种类似麦角多精的生物碱，抑制微管蛋白合成，对人畜安全造成威胁[3，4]。因此控制稻曲病的发生，对水稻生产及粮食安全至关重要。近年来，随着全球气候变化和矮秆紧凑型水稻品种、籼粳亚种间杂交稻组合的推广以及施肥水平的提高，稻曲病在我国各地稻区普遍发生，且逐年加重，已从次要病害上升为主要病害[5-7]。水稻稻曲病的防治研究逐渐成为目前关注和亟待研究解决的问题。

研究发现，水稻每穗谷粒数稀少、穗性较为松散的品种较为抗病[8，9]，但抗病品种往往不能满足优质高产的生产实际需求。因此，选择适当药剂并采用合适的施药方法是防治水稻稻曲病的重要措施。由于稻曲病菌的侵染途径及致病机制尚不明确[10，11]，化学防治仍较困难。当前用于防治水稻稻曲病的药剂主要有戊唑醇、氟环唑、咪鲜胺，均是麦角甾醇合成抑制剂。长期使用同类型药剂会提高病原菌抗药性产生的风险。将三唑类杀菌剂与非麦角甾醇合成抑制剂混配，有利于延缓稻曲病菌对三唑类杀菌剂抗药性的发展。阮宏椿等[12]室内毒力测定结果显示，苯醚甲环唑与井冈霉素A按1∶2的比例混配共毒系数为174.78，增效明显。李竞生等[13]采用菌丝干重法测定烯唑醇与井冈霉素混配对水稻稻曲病菌的毒力，发现二者按1∶3和1∶5的比例混配，SR值分别为1.812和1.905，表现出较好的增效作用。陈莉等[14]采用菌丝生长速率法测定药剂混配对该病菌的室内毒力，结果表明丙环唑与井冈霉素按1∶10的比例混配，SR值为1.92，增效作用良好。

结构类型不同的杀菌剂复配使用是提高防效、延缓抗药性发展、降低用药成本的重要途径[15]。药剂之间不同配比的联合作用效果评价是杀菌剂复配的基础研究工作。鉴于此，本研究测定了聚六亚甲基双胍盐酸盐与氟环唑单剂及其五种复配组合对水稻稻曲病菌的毒力，明确不同配比对该病菌的联合作用类型，以期为复配药剂的研制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试病原菌

供试病原菌为水稻稻曲病菌（U. virens），用PDA培养基、经常规组织分离法分离获得，经纯化、鉴定及按照柯赫氏法则（Kochs Rule）[16]进行致病性测定后保存备用。病株采自山东济南，试验于2013年10—11月在山东省农业科学院植物保护研究所实验室进行。

1.2 供试药剂

98.0%聚六亚甲基双胍盐酸盐原药、96.7%氟环唑原药，均由江苏辉丰农化股份有限公司提供。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计 根据单剂毒力测定结果，混剂毒力测定设置5个配比，聚六亚甲基双胍盐酸盐：氟環唑为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1。2种单剂及5种混剂组合质量浓度设置如下：

聚六亚甲基双胍盐酸盐单剂的7个系列测试浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg·L-1；

氟环唑单剂及5种混配组合的7个系列测试浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mg·L-1。

以药剂有效成分在培养基中的浓度为测试浓度[17]。空白对照为0.1%吐温-80水溶液。每处理重复4次。

1.3.2 药剂配制 聚六亚甲基双胍盐酸盐原药用无菌水稀释；氟环唑原药用二甲基甲酰胺溶解。采用逐级稀释法，用0.1%吐温-80水溶液稀释成各质量浓度的药液（药液浓度为1.3.1中所述测试浓度的30倍）。

1.3.3 试验方法 试验方法参照农业行业标准NY/T 1156.2—2006《农药室内生物测定试验准则杀菌剂第2部分：抑制病原真菌菌丝生长试验 平皿法》[18]。

在无菌条件下，用微量移液器从低浓度到高浓度，依次向装有29.0 mL加热融化的灭菌PDA培养基（温度50～55℃）的瓶内，注入1.0 mL药液，充分摇匀，分装到3个培养皿（直径为9 cm）中，得到相应浓度的含药平板。空白对照的培养基内，注入1.0 mL 0.1%吐温-80无菌水。

将供试病菌菌株于28℃条件下活化培养120 h，在无菌条件下，用灭菌打孔器（内径为0.6 cm）从其菌落边缘切取菌饼。用接种针在无菌条件下将菌饼转移至带药培养基平板中央，菌丝面朝下（菌丝面与培养基接触），每只培养皿内放置1个菌饼。将接菌后的培养皿于温度28℃条件下培养120 h，用游标卡尺十字交叉法测量菌落直径，取平均值，单位为毫米（mm）。按式（1）计算生长抑制率。

生长抑制率（%）=（1-药剂处理菌落增长直径空白对照菌落增长直径 ）×100（1）

1.4 统计分析

以药剂浓度对数值为x、以菌丝生长抑制率的几率值为y作回归分析，求得毒力回归曲线方程y=a+bx，计算各单剂及不同比例混剂的EC50及其95%置信限。

按Wadley法，计算增效系数（SR）；根据SR值评价药剂混用的联合作用类型，即SR﹤0.5为拮抗作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR﹥1.5为增效作用，公式如下。

式中，A、B分别为聚六亚甲基双胍盐酸盐、氟环唑单剂，PA、PB为相应单剂在混剂中的比例，EC50（th）为混剂EC50理论值，EC50（ob）为混剂EC50实测值。

2 结果与分析

2.1 聚六亚甲基双胍盐酸盐、氟环唑单剂对靶标病菌生长的影响

聚六亚甲基双胍盐酸盐浓度为0.1～100.0 mg·L-1时，对水稻稻曲病菌的生长抑制率为0.80%～61.89%；氟环唑浓度为0.05～50.0 mg·L-1时，对水稻稻曲病菌的生长抑制率为14.16%～87.44%，详见表1。

2.2 聚六亚甲基双胍盐酸盐与氟环唑混配对靶标病菌生长的影响

聚六亚甲基双胍盐酸盐与氟环唑5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1混配组合，浓度为0.05～50.0 mg·L-1时，对水稻稻曲病菌的生长抑制率分别为7.47%～78.15%、7.63%～76.06%、5.86%～72.21%、4.58%～60.00%、4.98%～57.59%，详见表2。

2.3 对靶标病菌的毒力及联合作用类型

表3数据表明，聚六亚甲基双胍盐酸盐与氟环唑对水稻稻曲病菌的EC50分别为44.111、1.743 mg·L-1，氟环唑对水稻稻曲病菌的室内生物活性明显高于聚六亚甲基双胍盐酸盐。聚六亚甲基双胍盐酸盐与氟环唑配比为25∶1的SR值为1.43，二者混配表现为相加作用。二者配比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的SR值分别为1.56、1.64、1.66、1.52，均大于1.5，表明上述4种混配组合对水稻稻曲病菌都表现为增效作用，配比为10∶1、15∶1时，SR值大，增效作用明显。

3 讨论与结论

不同作用位点的药剂混配能增强对病菌生长的干扰而具有增效作用，是药剂复配的基本原则之一。聚六亚甲基双胍盐酸盐是一种高分子聚合物，其中的阳离子与微生物细胞表面的阴离子部位形成静电吸附，阻碍细胞溶菌酶作用，使细胞表层结构变性破坏，从而杀死细菌或抑制细菌繁殖[19，20]。氟环唑是一种新型的三唑类杀菌剂，作用机制主要是抑制真菌中麦角甾醇的生物合成，导致细胞壁不可修复的损伤[21]。聚六亚甲基双胍盐酸盐与氟环唑作用位点不同，符合药剂复配的基本原则。另外，聚六亚甲基双胍盐酸盐对动植物细胞基本无影响，对各种材料也无侵蚀作用，可自然降解[22，23]。氟环唑与其混配，提高了药剂的安全性，符合绿色植保的理念。

本研究结果表明，氟环唑对水稻稻曲病菌的室内生物活性明显强于聚六亚甲基双胍盐酸盐；聚六亚甲基双胍盐酸盐与氟环唑以10∶1和15∶1配比混配，SR值分别为1.64和1.66，增效作用明显，为复配制剂的研发提供了试验依据。

在自然条件下，由于药剂对病害的作用效果还要受田间环境因素和其他病虫害发生情况等因素的影响，室内测定结果与田间实际防治效果可能存在一定差异，本研究为自然条件下试剂防效提供了参考，田间防效还需根据实际情况进一步验证。

参 考 文 献：

[1] 季宏平，张匀华，王芉，等. 水稻稻曲病发生为害调查及药效防治研究[J]. 中国农学通报，2001，17（4）：37-38.