山东栽培豆与野生豆抗裂荚基因SHAT1—5的克隆及序列分析

林延慧 李伟 张彦威 刘赟 王彩洁 徐冉 张礼凤

摘要：大豆的裂荚性是影响其产量的重要因素之一，因此栽培豆中豆荚开裂特性的遗传学机制成为国内外研究的热点。本研究以山东栽培豆（山宁11、山宁17、齐黄34、齐黄35和鲁0305-1）及山东野生豆（东营野生豆1、2号和山东野生豆1、2号）作为试验材料，根据已有报道，通过PCR扩增克隆了一个大豆抗裂荚基因SHAT1-5，并对该基因的序列进行多态性分析。结果显示，山东栽培豆和野生豆在SHAT1-5基因区约1 599 bp位置处，各自出现不同倍数的TAA重复。山东栽培豆与野生豆在SHAT1-5基因启动子上游4 kb关键调控区极度保守，栽培豆中不存在20 bp的缺失，这些结果与前人报道的东北栽培豆和野生豆中的情况有所不同。这表明，山东栽培豆与野生豆的裂荚性可能受其他基因的调控。

关键词：栽培豆；野生豆；裂荚；基因；多态性分析；启动子

中图分类号：S565.103.53文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）02-0001-06

Abstract Pod shattering is one of the important factors affecting soybean yield. Therefore， the genetic mechanism of pod shattering trait in cultivated soybean has become a hot spot at domestic and overseas. In this research， the cultivars including Shanning 11， Shanning 17， Qihuang 34 and Lu 0305-1， and the wild germplasms including Dongying wild soybean 1 and 2 and Shandong wild soybean 1 and 2 were used as experimental materials. According to the previous reports， we cloned a pod shattering resistant gene SHAT1-5 through PCR amplification， and analyzed its DNA polymorphism. The results showed that SHAT1-5 appeared different multiples of TAA repeats at 1599 bp location in Shandong cultivated and wild soybeans， respectively. The key regulation region of about 4 kb in upstream of SHAT1-5 promoter was extremely conservative， and no deletion of 20 bp was found in Shandong cultivated soybean. These results are different from the previous reports， indicating that the pod shattering trait of Shandong cultivated soybean and wild soybean may be regulated by other genes.

Keywords Cultivated soybean； Wild soybean； Pod shattering； Gene；Polymorphism analysis； Promoter

大豆原產于中国，已有五千多年的栽培历史，现已广泛栽培于世界各地。大豆是中国重要的粮食、油料作物，但是中国大豆的产量一直处于较低的状态，生产总量满足不了国内市场的需求。

栽培豆是由一年生野生豆驯化而来这一说法被广泛认同[1]。种子的散播或者果实开裂是大多数作物驯化过程中重要的农艺性状[2，3]。大豆的裂荚性是影响其产量的重要因素之一，因此，栽培豆中豆荚开裂特性的遗传学机制成为国内外研究的热点[4-8]。

有报道显示，东北栽培豆和野生豆中的抗裂荚基因为SHAT1-5[8]。本研究以山东栽培豆和野生豆作为试验材料，克隆抗裂荚基因SHAT1-5并对该基因及其蛋白序列进行分析，与前人报道结果进行比较，寻找山东大豆野栽和东北大豆野栽之间抗裂荚基因SHAT1-5的差异，为进一步挖掘控制山东大豆裂荚性基因提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以山东野生豆（东营野生豆1、2号和山东野生豆1、2号）及山东栽培豆品种（山宁11、山宁17、齐黄34、齐黄35和鲁0305-1）为试验材料。

试剂：CTAB、氯仿+异戊醇（24∶1）、异丙醇、乙醇、TE、TAE缓冲液、琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根）、pEASY-Blunt3 Cloning Kit、Trans1-T1感受态细胞、 LB液体培养基、氨苄青霉素、KOD FX酶。

1.2 DNA提取

取大豆苗期叶片，按照Rogers和Bendich（1998）的CTAB法（cetyltriethyl ammonium bromide），略作修改，进行DNA的提取。

1.3 基因克隆

PCR反应体系50 μL：DNA模板30 ng，dNTPs（2 mmol/L）10 μL， 2× KOD FX PCR buffer 25 μL，上游引物（10 μmol/L）1.5 μL，下游引物（10 μmol/L）1.5 μL，KOD FX（1 U/μL）1 μL，补水至50 μL。

PCR扩增程序：94℃预变性2 min；98℃变性10 min，58℃退火30 s，68℃延伸2 min，35个循环；68℃延伸10 min；4℃保存。

1.4 琼脂糖凝胶电泳

称取琼脂糖1 g，加入1×TAE缓冲液100 mL，加热，待琼脂糖完全溶解后，稍微放凉，加入Goldview摇匀，倒胶，插上梳子，放置20 min，待胶凝固之后开始点样，120 V电泳20 min。

1.5 目标片段的回收

利用天根公司的普通DNA产物纯化试剂盒（DP204）进行目的片段的回收。

1.6 载体连接

反应体系参照pEASY-Blunt3 Cloning Kit試剂盒。

1.7 连接产物的转化

将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，摇菌富集，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上、37℃恒温培养箱中过夜培养。

1.8 挑取单克隆及菌液PCR

在超净工作台中，向1.5 mL离心管内加入LB液体培养基（含有氨苄青霉素）500 μL，用灭菌的枪头挑取单克隆，放入离心管中，置于摇床上，37℃、220 r/min振荡培养40 min。

菌液PCR反应体系20 μL：DNA模板 30 ng，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，Taq buffer（10×）2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq酶（2.5 U/μL）0.2 μL，补水至20 μL。

PCR扩增程序：94℃预变性10 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.9 生物信息学分析

利用软件DNAMAN进行基因序列比对；利用软件InterProScan对SHAT1-5蛋白的结构域及二级结构进行分析。

2 结果与分析

2.1 材料裂荚性的调查

在大豆成熟期对栽培豆和野生豆的裂荚性进行观察记录（表1）。结果显示：山宁11、山宁17、鲁0305-1、山东野生豆1号和山东野生豆2号裂荚，齐黄34、齐黄35、东营野生豆1号和东营野生豆2号不裂荚。

2.2 引物序列信息

根据已知的裂荚基因SHAT1-5序列（SoyBase数据库https：//www.soybase.org/），利用Primer Premier 5软件设计扩增SHAT1-5基因启动子上游关键调控区的引物序列SHAT1-5 P4-F/R；根据已有的报道获得扩增SHAT1-5基因区的引物序列SHAT1-5 gene-F/R[8]；利用M13通用引物进行菌液PCR检测（表2）。

2.3 SHAT1-5基因启动子上游关键调控区的克隆及序列分析

利用引物SHAT1-5 P4-F/R克隆山东栽培豆和野生豆9个品种中SHAT1-5基因的启动子上游关键调控区序列，获得了约1 kb大小的目的片段，用1%琼脂糖凝胶进行检测（图1）。

利用DNAMAN进行序列比对，结果表明，SHAT1-5基因启动子上游的关键性调控区序列在山东野生豆和栽培豆之间、裂荚和不裂荚材料之间是非常保守的，没有差异性（图2）。

2.4 SHAT1-5基因的克隆及序列分析

根据文献报道的扩增SHAT1-5基因区的引物序列SHAT1-5 gene-F/R[8]，对山东栽培豆和野生豆9个品种进行PCR扩增，获得了SHAT1-5基因区约1.8 kb大小的目的片段，用1%琼脂糖凝胶检测（图3），然后切胶回收。

将回收产物连接pEASY-Blunt3 克隆载体，并转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，通过载体上的通用引物M13进行PCR扩增（图4），根据菌液PCR结果挑选阳性单克隆进行测序。序列比对结果显示，不同品种在SHAT1-5基因区约1 599 bp位点上存在差异，TAA呈现出不同的重复，山宁11、山宁17和鲁0305-1是11个TAA重复；齐黄34、齐黄35是9个TAA重复；东营野生豆1、2号是6个TAA重复；山东野生豆1号是9个TAA重复，山东野生豆2号是10个TAA重复（图5）。

2.5 SHAT1-5蛋白的理化性质分析

对SHAT1-5蛋白的理化性质进行分析，结果显示，SHAT1-5蛋白由443个氨基酸残基组成，分子量约为49 kD，理论等电点pI为6.35。在组成SHAT1-5蛋白的18种氨基酸中，天冬酰胺（Asn）所占比例最高，达到10.8%，色氨酸（Trp）所占比例最低，仅为1.6%（表3）。SHAT1-5蛋白的不稳定指数为43.38，表明该蛋白不稳定。

2.6 SHAT1-5蛋白的结构域及二级结构分析

利用InterProScan软件对SHAT1-5蛋白进行结构域分析，发现该蛋白含有一个NAC结构域（图6），并对该蛋白的二级结构进行预测，结果如下：SHAT1-5蛋白中包含4个α-螺旋（紫色圆柱），7个β-折叠（黄色箭头），其余部分为不规则卷曲（黑色直线）（图7）。

3 讨论与结论

在禾谷类作物中，落粒性与离层的消失有关，即花梗与外稃之间相连接处发生改变[9-13]。然而，单子叶植物（谷类）和双子叶植物（豆类）在果实结构上的差异暗示着种子落粒和豆荚开裂的机制有所不同[14-16]。

拟南芥、水稻和高粱中，已经成功克隆与落粒性相关的基因。在拟南芥中，SHP1和SHP2是两个与裂荚性状相关的MADS-box基因，SHP1和SHP2编码重复的蛋白，可以促进IND和ALC编码转录因子bHLH，进而促使离区的发育[17-19]。水稻中，通过QTL定位成功分离了与种子落粒相关的基因，如sh4、qSH1、OsCPL1和SHAT1等[20-23]。高粱中克隆的第一个落粒基因是Sh1[13]。

目前國内外对大豆裂荚性状的研究大多处在分析其QTL 的水平。一个裂荚性状的主效 QTL （qPDH1） 位于J连锁群上Sat_093和 Sat_366这两个标记之间，并在不同的遗传背景下证明该位点控制大豆裂荚的表型[24，25]。Funatsuki等通过图位克隆的方法分离了一个裂荚抗性基因Pdh1，该基因在豆荚壁富含木质素内侧厚壁组织中，尤其在木质素沉积的初期高强度表达，从而增加干豆荚壁的扭曲度，促使裂荚[7]。还有报道称，从野生大豆到栽培大豆的驯化过程中，受到强烈人工选择的NAC基因家族SHAT1-5基因，其启动子上游约4 kb处的一个20 bp的抑制子缺失，导致SHAT1-5在栽培大豆纤维帽细胞中的表达量与野生豆相比提高了15倍，致使次生壁增厚，从而有效阻止了豆荚的自然开裂过程，该机制与禾谷类作物由于离层的失去导致落粒抗性的分子机制完全不同。该研究还对17种栽培豆和野生豆进行单倍型分析，结果发现，栽培豆在SHAT1-5基因区约1 599 bp的位点处都呈现11个TAA重复，野生豆在该位点处呈现6、7、9和10个TAA重复[8]。

本研究以山东本地的野生豆和栽培豆作为试验材料，克隆了SHAT1-5基因，并对其基因和蛋白序列进行分析，结果发现，山东栽培豆和野生豆在SHAT1-5基因启动子上游20 bp抑制子处极度保守，野栽之间不存在差异；进而对山东栽培豆和野生豆的SHAT1-5基因序列进一步分析，发现山东栽培豆在SHAT1-5基因区约1 599 bp的位点处存在9和11个TAA重复，而野生豆在该区间内呈现出不同的TAA重复，分别为6、9和10个TAA重复。本研究结果与前人报道的结果不同，因此，山东大豆的裂荚性不受SHAT1-5基因的调控，可能受其他基因的控制。

参 考 文 献：

[1] Purugganan M D， Fuller D Q. The nature of selection during plant domestication [J]. Nature， 2009， 457（7231）：843-848.

[2] Hymowitz T. On the domestication of soybean [J]. Economic Botany， 1970， 24（4）：408-421.

[3] Diamond J. Evolution， consequences and future of plant and animal domestication [J]. Nature， 2002， 418（6898）：700-707.

[4] Petersen M， Sander L， Child R， et al. Isolation and characterisation of a pod dehiscence zone-specific polygalacturonase from Brassica napus[J]. Plant Molecular Biology， 1996， 31 （3）：517-527.

[5] Suzuki M， Fujino K， Funatsuki H. A major soybean QTL， qPDH1， controls pod dehiscence without marked morphological change[J]. Plant Production Science， 2009，12（2）：217-223.

[6] Yamada T， Funatsuki H， Hagihara S， et al. A major QTL， qPDH1， is commonly involved in shattering resistance of soybean cultivars[J]. Breeding Science， 2009， 59（4）：435-440.

[7] Funatsuki H， Suzuki M， Hirose A， et al. Molecular basis of a shattering resistance boosting global dissemination of soybean [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2014， 111（50）：17797-17802.

[8] Dong Y， Yang X， Liu J， et al. Pod shattering resistance associated with domestication is mediated by a NAC gene in soybean [J]. Nature Communications， 2014， 5（2）： 3352.

[9] Olsen K M， Wendel J F. A bountiful harvest： genomic insights into crop domestication phenotypes [J]. Annual Review of Plant Biology， 2013， 64（1）：47-70.

[10]Doebley J F， Gaut B S， Smith B D. The molecular genetics of crop domestication [J]. Cell， 2006， 127（7）：1309-1321.

[11]Li C， Zhou A， Sang T. Rice domestication by reducing shattering [J]. Science， 2006， 311（5769）：1936-1939.

[12]Simons K J， Fellers J P， Trick H N， et al. Molecular characterization of the major wheat domestication gene Q[J]. Genetics， 2006， 172（1）：547-555.

[13]Lin Z， Li X， Shannon L M， et al. Parallel domestication of the Shattering1 genes in cereals [J]. Nature Genetics， 2012， 44（6）：720-724.

[14]Lenser T， Theien G. Molecular mechanisms involved in convergent crop domestication [J]. Trends in Plant Science， 2013， 18（12）：704-714.

[15]Tiwari S P， Bhatia V S. Characters of pod anatomy associated with resistance to pod-shattering in soybean [J]. Annals of Botany， 1995， 76（5）：483-485.

[16]Christiansen L C， Dal D F P， Borkhardt B. Examination of the dehiscence zone in soybean pods and isolation of a dehiscence-related endopolygalacturonase gene [J]. Plant Cell & Environment， 2002， 25（4）：479-490.

[17]Liljegren S J， Ditta G S，Eshed Y， et al. SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis[J]. Nature， 2000， 404（6779）：766-770.

[18]Liljegren S J，Roeder A H，Kempin S A，et al. Control of fruit patterning in Arabidopsis by INDEHISCENT [J]. Cell， 2004， 116（6）：843-853.

[19]Rajani S， Sundaresan V. The Arabidopsis myc/bHLH gene ALCATRAZ enables cell separation in fruit dehiscence [J]. Current Biology， 2001， 11（24）：1914-1922.

[20]Konishi S， Izawa T， Lin S Y， et al. An SNP caused loss of seed shattering during rice domestication [J]. Science， 2006， 312（5778）：1392-1396.

[21]Li C， Zhou A， Sang T. Rice domestication by reducing shattering [J]. Science， 2006， 311（5769）：1936-1939.

[22]Zhou Y， Lu D， Li C， et al. Genetic control of seed shattering in rice by the APETALA2 transcription factor SHATTERING ABORTION1[J]. Plant Cell， 2012， 24（3）：1034-1048.

[23]Ji H， Kim S R， Kim Y H， et al. Inactivation of the CTD phosphatase-like gene OsCPL1 enhances the development of the abscission layer and seed shattering in rice [J]. Plant Journal， 2010， 61（1）：96-106.

[24]Funatsuki H， Hajika M， Hagihara S， et al. Confirmation of the location and the effects of a major QTL controlling pod dehiscence， qPDH1， in soybean [J]. Breeding Science， 2008， 58（1）：63-69.

[25]Funatsuki H， Ishimoto M， Tsuji H， et al. Simple sequence repeat markers linked to a major QTL controlling pod shattering in soybean [J]. Plant Breeding， 2006， 125（2）： 195-197.