骨骼内分泌功能研究进展

李文洲,解琪琪,史卫东,邓亚军,马玉靖,谢建琴,康学文,汪 静*

(1.兰州大学第二医院骨科,中国甘肃兰州730030；2.兰州大学甘肃省骨关节疾病研究重点实验室,中国甘肃兰州730030；3.兰州大学第二医院,中国甘肃兰州730030)

骨组织是由骨组织细胞、胶原纤维和基质共同组成的复杂组织。骨组织细胞包括骨细胞、骨原细胞、成骨细胞及破骨细胞。细胞间质主要含有胶原纤维、中性或弱酸性的糖胺多糖和钙盐。既往研究认为骨骼的主要功能包括:机械支持、保护重要器官、提供造血微环境、参与钙磷代谢。近年越来越多的证据表明,骨骼不仅是接受神经和体液调节的“惰性器官”,而且是具有生物活性的“内分泌器官”[1]。骨骼能合成和分泌多种生物活性物质,包括骨调节蛋白、活性多肽、生长因子、脂肪因子、炎性因子、激素[2]和外泌体等。这些生物活性物质既能通过自分泌和旁分泌方式作用于骨自身,调节骨骼系统的发育和代谢,又能经循环系统以远距分泌的方式作用于各靶器官和组织,发挥相应的生物学作用,包括调节机体能量代谢、参与炎症反应、维持内分泌稳态等。本文将从以下方面简述近年来骨骼内分泌功能的研究进展。

1 骨骼分泌的骨调节蛋白

1.1 骨保护素(osteoprotegerin,OPG)

OPG是从破骨细胞中发现的一种可溶性分泌型糖蛋白,与 RANK(receptor activator of NF-κB)、RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)同属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)受体超家族的成员。OPG作为NF-κB的配体受体及RANKL的可溶性诱饵受体,与RANK竞争性抑制RANKL-RANK的相互作用,加强成骨细胞的增殖和分化,抑制破骨细胞的增殖和分化,从而促进骨形成。因此现有研究认为,OPG/RANK/RANKL通路在调节骨的形成和吸收平衡中发挥着重要的作用。Simonet等[3]报道,重组OPG可以防止去卵巢大鼠的骨丢失,增加股骨干骺端的骨密度,显著增加骨小梁的数量；同样,在OPG转基因小鼠的研究中,上述结论也得到了证实。Szulc等[4]在一项前瞻性研究中发现,血清OPG水平与老年男性的骨折风险和心血管事件呈正相关。大量研究表明OPG的表达水平与多种疾病相关,如心血管疾病、糖尿病、肥胖症、高血压和代谢综合征等[5]。

1.2 骨钙素(osteocalcin,OCN)

OCN是由成骨细胞特异性分泌的一种非胶原蛋白,于1975年首次被发现。OCN的相对分子质量小,由 49～51 个氨基酸组成,在 21、24、27 位有3个γ-羧基谷氨酸,故又称骨谷氨酸蛋白(bone Gla-protein,BGP)。大部分骨钙素因与羟基磷灰石结合而沉积于骨基质中,少部分分泌入血。血清骨钙素能敏感且特异地反映成骨细胞活性,是骨合成代谢的特异性标志物。OCN基因敲除小鼠表现出骨形成增加,骨量增加[6],提示OCN具有抑制骨形成的功能。有证据表明,OCN敲除小鼠血清胰岛素水平下降,糖耐量减低,胰岛素抵抗增强[7]。OCN与糖代谢和胰岛素抵抗有关,可能成为糖尿病治疗的新靶点。此外,OCN具有调节能量代谢和雄性生殖的功能。Chamouni等[8]报道,OCN基因缺陷小鼠的睾丸、附睾和精囊的质量减轻,精子数量减少了50%,提示OCN可促进睾丸间质细胞成熟和睾酮的分泌,从而提高雄性的生殖能力。临床研究同样显示,男性青春期血清OCN水平与睾酮水平呈正相关[9]。此外,有文献表明,成骨细胞分泌的OCN在肿瘤浸润和转移中发挥着重要的作用[10]。随着对OCN的深入研究,OCN将来可能成为临床疾病的标志物和治疗新靶点。

1.3 骨桥蛋白(osteopontin,OPN)

OPN是一种高度糖基化及磷酸化的分泌型蛋白质,主要由骨细胞、成骨细胞分泌,也可由中性粒细胞、树突状细胞、NK细胞、T细胞和B细胞分泌。OPN具有多种生理学功能,在骨重建过程中,可将破骨细胞锚定在骨的矿化基质中。OPN同样在细胞的分化中起着重要作用,通过与整合素αvβ1相互作用,使骨髓间充质干细胞的成脂分化作用受到抑制,促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[11]。Ihara等[12]的研究发现OPN基因敲除后,破骨细胞数量显著减少,甲状旁腺激素诱导的骨吸收作用明显减弱。另外,OPN能招募巨噬细胞,促进细胞的吸附和迁徙,激活细胞内级联反应,影响细胞介导的免疫反应,从而调控先天性和适应性免疫系统,这提示OPN与免疫系统存在复杂的网络调控,并与多种自身免疫性疾病相关。Daniele等[13]的研究证实当人的糖耐量下降时,循环中的OPN水平是增加的。这一发现提示,OPN或许是糖尿病发病前期的潜在预测因子。

1.4 骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)

BSP大部分是由成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞合成,主要分布于牙齿、骨骼及钙化的软组织和骨的交界区域,是具有分泌性、高度糖基化和磷酸化的细胞基质蛋白质。Xu等[14]的在体实验研究显示,BSP可以通过促进早期骨矿化增强成骨细胞的分化和新骨的沉积。相关研究报道,BSP与多种肿瘤的侵袭转移相关,参与了肿瘤细胞的黏附、血管生成、抗细胞凋亡和骨破坏等过程[15]。此外,有研究发现,血清BSP水平与终末期肾病维持性血液透析患者的腹主动脉钙化评分相关,血清BSP浓度可能有助于维持性血液透析患者腹主动脉钙化程度的预测[16]。

1.5 骨织素(osteocrin,OSTN)

OSTN由103个氨基酸构成,相对分子质量为11.4 kD,是从成骨细胞中分离出来的一种分泌性蛋白质,表达于白色脂肪和肌肉组织中。OSTN的表达量在出生时达到高峰,随着年龄的增长而显著下降。Thomas等[17]的研究发现,OSTN转基因小鼠出现长骨延长表型；并且OSTN受1,25-羟维生素D3的直接调控。Kanai等[18]报道,OSTN能选择性与钠尿肽清除受体结合,减少C型钠尿肽的清除,从而刺激骨骼的生长发育,为骨骼生长障碍疾病的治疗提供了新的治疗方法。另外,Miyazaki等[19]研究表明,OSTN可以通过抑制钠尿肽的清除,减少心肌梗死后的充血性心力衰竭。Ataman等[20]发现,OSTN在灵长类动物大脑皮层中有表达,并可抑制神经元兴奋后的树突和细胞生长,提示骨分泌的OSTN可能对大脑神经元的形态有调节作用。

1.6 骨硬化蛋白(sclerostin,SOST)

骨硬化蛋白是由骨硬化蛋白基因(SOST)编码、成熟的骨细胞分泌的一种分泌型糖蛋白。骨硬化蛋白作为Wnt和骨形态发生蛋白的抑制剂,对骨形成具有负性调节作用,可以抑制Wnt/β-catenin信号通路,抑制成骨细胞的成骨作用,使骨量下降[21]。Tamplen等[22]研究表明骨硬化蛋白抗体能促进小鼠下颌骨的形成,提示骨硬化蛋白抗体在下颌骨缺陷疾病(如唐氏综合征)的治疗中具有重要的意义。Bhattacharyya等[23]报道,骨硬化蛋白单克隆抗体能增加绝经妇女的骨密度,不仅可以促进骨形成,而且可以减少骨吸收。这些研究为骨质疏松症的治疗提供了新思路。除此之外,骨硬化蛋白在糖代谢、脂肪代谢以及多种疾病中也发挥着重要的作用[21]。

1.7 胚胎干细胞磷酸酶(embryonic stem cell phosphatase,ESP)

ESP是由Esp基因编码的一种蛋白酪氨酸磷酸酶,最早由Mauro等[24]从大鼠成骨细胞和睾丸生殖细胞中分离出来。ESP除在骨、睾丸、卵巢和胚胎组织中大量表达外,少量表达于心、脑、肾、肝、脾等组织。Chengalvala等[25]在体外培养的成骨细胞中,用反义寡核苷酸抑制Esp基因的表达后,发现大鼠成骨细胞的分化功能丧失,表明ESP参与成骨细胞的分化过程。有研究发现,甲状旁腺激素PTH能促进ESP mRNA的表达[26],提示ESP可能是PTH调节成骨细胞功能的一个中间环节。相关研究发现,Esp基因敲除的小鼠,其血胰岛素水平和脂联素水平增加,而血浆中甘油三酯和内脏脂肪水平显著降低,且肌肉和肝脏摄取的糖明显增加,提示ESP参与了能量代谢的调节[27]。

1.8 Kalirin蛋白

Kalirin是一种鸟苷酸交换因子,它通过促进GDP/GTP交换而增强小G蛋白Rho-GTP酶的活性,从而发挥生物学功能。Kalirin主要有3个亚型,Kalirin-7、Kalirin-9 和 Kalirin-12。目前,Kalirin已被证实与细胞骨架重塑及神经突触和树突棘的发生、延伸有关,在神经退行性疾病和精神障碍的发病中起着重要作用[28]。Huang等[29]发现,Kalirin在成骨细胞和破骨细胞中也有表达,Kal-KO雌性小鼠股骨远端骨小梁数量减少,骨皮质厚度显著下降。同时,离体实验表明,Kalirin的缺失直接影响破骨细胞和成骨细胞活性,导致成骨细胞分泌的OPG减少,改变RANKL/OPG比例并促进破骨细胞生成。因此,目前研究认为Kalirin可能通过旁分泌或内分泌方式调节骨骼的重塑并维持骨量。

骨骼分泌的骨调节蛋白广泛参与成骨过程,调节骨骼的生长和发育,在机体的病理生理过程中发挥着重要作用。OPG、OCN、OPN、ESP等骨调节蛋白均可调节成骨细胞的增殖和分化,从而影响骨表型改变,可能导致包括骨质疏松症在内的多种疾病。此外,骨调节蛋白对其他组织和器官的作用也值得重视。OPG、OCN、OPN、ESP参与了机体的糖代谢和脂代谢,但是其具体机制尚不清楚,仍然需要进行大量的基础和临床研究。有意义的是OCN可调节男性生殖能力,这表明骨骼和生殖系统之间的关系不仅局限于性腺对骨重塑的调节,还存在骨骼对性腺的正反馈调节。同样,Kalirin促进树突棘和神经突触延伸的作用表明,骨骼和大脑之间存在调控关系。深入研究Kalirin的生物学作用,可能揭示脑损伤促进骨折愈合的机制,同时也可为脊髓损伤的修复提供新的治疗思路。总之,骨骼与其他器官和组织存在着复杂的网络调控机制,骨骼分泌的骨调节蛋白广泛参与了机体的活动,维持着机体的内环境稳态。

2 骨骼分泌的生长因子

2.1 成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)

FGF23是由成骨细胞和骨细胞分泌的一种参与钙磷代谢调节的细胞因子,属于FGF超家族的成员之一。由于其结构特殊,因此很容易释放并进入血液,发挥类似内分泌激素的作用。FGF23在肾脏的主要生物功能是通过降低Ⅱ型钠磷协同转运蛋白的表达,抑制磷吸收,降低血磷。同样,FGF23可以通过抑制Cyp27b1,激活24-羟化酶,从而降低血液中1,25(OH)2D的水平[30]。两者的共同作用,使机体内的钙磷水平处于动态平衡。在FGF23基因敲除的小鼠中,血磷和血1,25(OH)2D均升高。大多数情况下,在Klotho蛋白的参与下,FGF23才能发挥生理学功能。Klotho-EGFR复合物能增加FGF23与其受体的亲和力。中国学者的一项横断面研究表明,在CKD(chronic kidney disease)患者中,FGF23可能参与了心脏瓣膜钙化的过程,是心脏瓣膜钙化的危险因素[31]。有文献报道,延长血液透析时间能降低血液透析患者FGF23的水平,有利于左心室重构[32],提示FGF23可能是血液透析患者左心室功能的生物标志物。

2.2 胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)

IGF-1是一类促进细胞生长、具有胰岛素样代谢效应的因子,主要由肝脏和其他组织产生,可与IGF-1受体结合,调节细胞的增殖、分化和蛋白质合成。近年来研究发现骨细胞和软骨细胞也可分泌IGF-1[33],在骨形成和骨矿物代谢中发挥着重要的调控作用[34,35]。Sheng等[33]报道,骨细胞特异性IGF-1敲除小鼠的骨膜周长、骨横截面积、骨长度均减小；而肝细胞特异性IGF-1敲除小鼠中,骨的长度和尺寸不受影响,提示骨细胞来源的IGF-1在骨生长中起到了关键的调节作用。相关研究表明,缺乏功能性IGF-1基因的人可能患有严重的骨质疏松症[36]。后续研究发现,经重组人IGF-1(rhIGF-1)治疗两年后,妊娠相关血浆蛋白-A2(pregnancy-associated plasma protein-A2,PAPP-A2)缺陷儿童的骨矿含量、骨密度和骨小梁评分均增加[37],这提示IGF-1或许是治疗骨质疏松症和矮小症的一个潜在靶点。此外,IGF-1在骨折的愈合、胰岛素抵抗的改善以及β细胞功能的提升中也发挥了相应的生物学效应[38]。

众所周知,肾脏是调节机体钙磷代谢和维持酸碱平衡的重要器官。近年来,骨-肾轴对钙磷代谢及酸碱平衡的调节越来越得到重视,最新观点认为骨骼和肾脏相辅相成共同维持机体的稳态。实际上,骨骼也是一个重要的调节机体酸碱平衡的器官,骨-肾轴的紊乱可导致钙磷代谢失衡,引起钙磷的异位沉积。FGF23作为骨骼分泌的重要生长因子之一,在CKD患者矿物代谢紊乱及肾外并发症的进展中具有负面效应。深入探讨FGF23在CKD病理生理学过程中的机制,是治疗CKD及其肾外并发症的关键所在。骨骼的生长方式包括软骨内成骨和膜内成骨。发育性骨骼生长受到各种激素、生长因子、机械因素的复杂调控。普遍认为IGF-1是一种强有力的骨纵向生长刺激因子,在骨骼生长中起着极其重要的作用,但是具体机制尚不清楚。明确IGF-1与骨骼生长的相关性,对于骨质疏松症和矮小症的治疗与预后具有重要意义。

3 骨骼分泌的脂肪因子

3.1 瘦素(leptin)

瘦素是肥胖基因的产物,主要由白色脂肪细胞分泌。2001年,Reseland等[39]首次在原代培养的人成骨细胞中检测到瘦素及其受体的表达,并报道了瘦素促进骨矿化的作用。Steppan等[40]研究显示,瘦素能显著增加ob/ob小鼠股骨的骨小梁数量、股骨长度、骨皮质厚度、骨矿含量和骨密度,提示瘦素是强有力的骨生长刺激因素。但Hamrick等[41]研究发现,瘦素缺乏的ob/ob小鼠,其椎体的长度、腰椎骨密度、腰椎骨矿含量、腰椎骨小梁体积显著增加,呈现出与股骨相反的表型,表明瘦素对四肢骨和脊柱骨的作用机制不同,有待于进一步研究。另有证据表明,瘦素在骨折的愈合中发挥了重要作用,瘦素缺乏可消除创伤性脑损伤对骨愈合的积极作用[42]。此外,有临床资料显示,肥胖患者血清瘦素水平与发生骨质疏松的危险性呈负相关[43]。

3.2 脂联素(adiponectin,APN)

脂联素是主要由白色脂肪组织分泌产生的一种脂肪因子,在结构上与TNF-α、RANKL相似。它可通过寡聚化形成不同的寡聚体,经血液循环作用于脂联素受体发挥生物作用。2004年,Berner等[44]发现脂联素及其受体在人股骨和胫骨的成骨细胞中也有表达。Wang等[45]的研究表明脂联素不仅可通过 Wnt/β-catenin通路促进BMSC(bone mesenchymal stem cell)的成骨分化和成骨作用,而且可以通过内分泌作用直接影响骨代谢。在动物层面,Naot等[46]研究发现,雌性APN-KO小鼠股骨远端的骨面积、骨面积分数、皮质厚度均减少,但骨强度没有变化,提示脂联素与骨代谢之间的关系有待进一步研究。吕雪等[47]将人脂联素重组腺病毒注入到大鼠胫骨骨缺损区内,发现局部应用hAPN基因重组腺病毒对大鼠骨缺损修复具有促进作用。Zhan等[48]开展的一项横断面研究发现,老年人血浆脂联素水平与胸主动脉钙化的发病率呈负相关,是心血管系统的保护因素,提示血浆脂联素水平可能是老年人胸主动脉钙化的潜在预测因子。

瘦素和脂联素都可由白色脂肪组织产生,也可由成骨细胞产生。脂肪细胞和成骨细胞分化的不平衡可导致骨髓脂肪化和骨量的丢失,继而引发严重的骨质疏松症。特别是机体患糖尿病或肥胖时,糖代谢和脂肪代谢均处于紊乱状态,可影响成骨细胞和破骨细胞的动态平衡,最终导致骨代谢紊乱。由此可知,机体的能量代谢和骨代谢并不是孤立存在的,而是一个互相联系、互相调控的动态平衡网络体系。深入探讨能量代谢和骨代谢之间的分子机制,明确它们之间的调控关系,可能是治疗代谢性疾病的重要突破点。

4 骨骼分泌的细胞因子

白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是一种多功能细胞因子,可由多种细胞产生,如B细胞、T细胞、脂肪细胞和成骨细胞。IL-6参与多种生物学过程,包括免疫应答、脂质代谢和骨代谢等。有研究表明,IL-6能通过抑制RANKL信号通路抑制破骨细胞生成和骨吸收[49]；但Yokota等[50]报道,IL-6能刺激破骨前体细胞分化为成熟的破骨细胞和活性破骨细胞,这表明IL-6对破骨细胞的作用是双向的,有待进一步探索。Wang等[51]的研究表明,高脂饮食能减少成骨细胞生成,增加破骨细胞和成脂细胞生成,导致骨小梁丢失；而敲除IL-6基因能拮抗高脂饮食诱导的骨小梁丢失[52]。由此可知,IL-6是连接脂肪代谢和骨代谢的重要桥梁。最近的一项研究显示,IL-6基因敲除小鼠可适应性抑制NF-κB和AP1的活性,阻遏Wnt信号,预防去势小鼠的骨量丢失,并增加已骨质疏松去势小鼠的骨密度[53]。但是,也有研究显示IL-6基因敲除小鼠未出现骨表型改变[54]。由此可知,IL-6在骨代谢的调节中是一把“双刃剑”。

IL-6是一种多功能细胞因子,其发挥作用的方式和通路不尽相同,所以无论是体内研究还是体外研究都可能会出现截然相反的结果,但是并不能否认其在骨代谢中的重要作用。目前的研究认为IL-6发挥何种作用取决于机体内部的微环境。随着生物信息学和代谢组学的迅猛发展,相信IL-6的真相终究会被揭示。

5 骨骼分泌的活性多肽

甲状旁腺素相关肽(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)最早是在致高钙血症的恶性肿瘤组织中被发现的一种活性肽。近年发现PTHrP在成骨细胞和骨细胞中也有表达。Ansari等[55]研究发现PTHrP可以以旁分泌和自分泌的形式,与PTHR1受体结合,刺激骨形成,增强骨皮质的强度。在国外,PTHrP相关药物已被FDA批准为治疗骨质疏松的临床用药。Xu等[56]研究证明,PTHrP参与了乳腺癌的恶性进展,与乳腺癌骨转移密切相关。研究者推测这可能是由于PTHrP能调控血管平滑肌细胞的增殖,调节血管平滑肌的紧张度,从而为乳腺癌的恶性进展提供血管支持。因此,该研究认为PTHrP可能是雌激素受体阴性乳腺癌的潜在诊断标志物。此外,文献报道,在胰腺部分切除小鼠模型中,PTHrP能促进β细胞的增殖,显著提升β细胞的再生能力[57]。糖尿病患者胰岛β细胞数量和功能明显减退,只能依靠降糖药物或器官移植治疗,由于器官来源短缺以及移植免疫反应的存在,大大限制了器官移植的临床应用。PTHrP的应用前景可能为糖尿病患者带来新的曙光。但是骨骼来源的PTHrP具体能发挥多大作用仍有待进一步研究。

生理条件下,PTHrP主要发挥促进成骨细胞增殖、减少成骨细胞凋亡、调节细胞钙转运的作用。病理条件下,由于PTHrP是恶性肿瘤相关高钙血症的关键诱导因子,因此PTHrP的表达失调与癌症的转移密切相关。最新的观点认为,PTHrP一方面可促进癌细胞的增殖,增强癌细胞的扩散和转移能力,特别是乳腺癌、肺癌、前列腺癌的骨转移；另一方面可以调节骨髓微环境,有利于癌细胞定植。由此可知,PTHrP或许是抑制癌症骨转移的一个潜在的作用靶点。

6 骨骼分泌的激素

脂质运载蛋白2(lipocalin 2,LCN2)是脂质运载蛋白家族的成员之一,是一种含有178个氨基酸残基的分泌性糖蛋白,之前被认为其完全由脂肪细胞分泌。最新研究发现,LCN2在成骨细胞中的表达量至少是白色脂肪组织的10倍。Mosialou等[58]发现骨源性LCN2能穿越血脑屏障,与下丘脑中的黑皮质素受体4(MC4R)结合,并激活下游通路,从而抑制食物的摄入；此外,它还能诱导胰岛素分泌,改善胰岛素的敏感性,提高糖耐量,提示LCN2在体重和骨的承重中扮演着某种重要角色。Capulli等[59]的研究显示,Lcn2-/-小鼠不仅表现出低骨量、骨小梁数量和体积减少表型,而且表现出空腹血糖降低和高胰岛素血症,这表明LCN2在骨代谢和糖代谢中具有复杂的调控关系。Costa等[60]研究表明,骨中LCN2过表达能调控骨髓的造血微环境,促进老年小鼠的红细胞生成,但是具体机制尚不清楚。由此可知,骨骼不只是被动地接受骨髓微环境的调节,还存在骨骼对骨髓微环境的反馈机制。

LCN2的研究表明骨骼可通过分泌激素控制食欲,从而影响机体的能量代谢。这是骨骼内分泌功能的典型代表,同时说明骨骼和大脑之间存在复杂的反馈机制,骨骼和大脑相互作用共同维持着机体的稳态。尽管如此,LCN2的生物学功能仍需大量的临床试验去验证。

7 结语

在成人,骨骼约占体重的五分之一。既往研究认为骨骼的主要功能包括:机械支持、保护重要器官、提供造血微环境、参与钙磷代谢。近年骨骼的内分泌功能逐渐被挖掘出来,拓展了人们对骨骼的认识。随着认识的深入,骨骼不再仅仅是被动接受神经和体液调节的器官,而是一个参与机体全身调节的内分泌器官。骨骼分泌的活性物质,除了可作用于自身,调节骨骼的生长和发育；还可以作用于其他组织和器官,发挥多种功能,如能量代谢、炎症反应、生育能力调节、肿瘤的侵袭和转移、造血微环境、饮食摄入等。

近年来,尽管骨骼的内分泌功能研究取得了重大进展,但是尚有许多不足之处。目前骨骼内分泌功能的研究主要集中于成骨细胞,鲜有针对骨细胞和破骨细胞的研究,应用成骨细胞和破骨细胞共培养体系进行的研究更为少见。此外,骨源性生物活性物质在机体调节中所占有的比例、发挥作用的明确机制、潜在的应用前景等问题仍然值得深入探讨。随着生物信息学、代谢组学、基因组学的快速发展,骨骼内分泌的奥秘终将会被揭示,同时也会推动早期诊断、药物研发、治疗手段的进步。