甲烷厌氧氧化机理及其应用研究进展

吴忆宁, 梅娟,2,3*, 沈耀良,2,3



甲烷厌氧氧化机理及其应用研究进展

吴忆宁1, 梅娟1,2,3*, 沈耀良1,2,3

1．苏州科技大学环境科学与工程学院, 苏州 215009 2．城市生活污水资源化利用技术国家地方联合工程实验室, 苏州 215009 3．江苏省环境科学与工程重点实验室, 苏州 215009

甲烷是一种重要的温室气体, 研究证明甲烷厌氧氧化(AOM)对于降低全球甲烷的排放有着重要意义。参与AOM反应的最终电子受体可分为三类, 即SO2– 4、NO2–/NO3–以及以Fe3+、Cr5+等为代表的金属离子。本文基于甲烷厌氧氧化过程所利用的电子受体的差别, 结合不同类型AOM反应微生物的基因型分析, 阐述了AOM过程的反应机理、相关的微生物种类及其代谢途径。其中对AAA(AOM-associated archaea, 属于ANME-2d)的分离培养, 以及其利用硝酸盐、Fe3+、Cr5+等离子氧化甲烷的研究对认识AOM反应机理和AOM的实际应用有很大推动作用。本文还介绍了AOM过程在环境污染控制领域实际应用中的最新研究进展, 对AOM的实际应用及其在节能减排上的价值进行展望。AOM过程的进一步研究对拓宽该过程的工程应用以及对正确认识全球碳、氮、硫循环均有着重要意义。

甲烷厌氧氧化; 电子受体; 甲烷厌氧氧化古菌; 环境污染控制

甲烷在地球生物演化过程以及人类的生活生产中扮演着重要的角色。它是一种重要的化石燃料, 是一种不可忽视的温室气体, 是自然界中一种丰富的碳氢化合物, 同时也可作为微生物生长的底物[1]。甲烷对温室效应的贡献仅次于二氧化碳, 达到了20%, 它对全球变暖的影响是二氧化碳的25倍。在过去的30年中, 大气中甲烷的含量从1.6 ppm增至1.8 ppm (然而在1999年至2006年, 该值一直保持稳定)。控制大气中甲烷浓度对控制全球变暖有重要意义[2,3]。

甲烷的厌氧氧化(Aerobic methane oxidation, AOM)是减少甲烷的重要途径之一。AOM反应普遍存在, 海洋沉积物、冷泉区、泥火山和天然气水合物储层上方以及人类活动的水稻田、垃圾填埋场等存在甲烷气体渗漏逃逸的区域都能检测到AOM反应的发生[3]。根据最终电子受体的不同, 甲烷厌氧氧化可分为3类, 一类是以SO2- 4为最终电子受体, 被称为硫酸盐还原型甲烷厌氧氧化(Sulphate-reduction- dependent aerobic methane oxidation, SAMO); 一类以NO2–、 NO3–为最终电子受体, 被称为反硝化型甲烷厌氧氧化(Denitrification-dependent anaerobic methane oxidation, DAMO); 第三类是Fe3+、Mn4+、Cr5+、MnO4—等离子为电子受体的甲烷厌氧氧化[4]。

深入了解和研究不同环境中的甲烷厌氧氧化过程和机理, 对进一步理解全球碳循环和控制甲烷气体的排放都有重要意义。

1 以SO2– 4为最终电子受体的硫酸盐还原型甲烷厌氧氧化(SAMO)

AOM反应最早是在海洋沉积物中发现。海洋中发生的AOM 过程主要由甲烷厌氧氧化古菌( Anaerobic methanotrophic archaea, ANME) 和硫酸盐还原细菌( Sulfate-reducing bacteria, SRB) 共同完成, 其化学计量关系可表示为[5]:

CH4+ SO2– 4→ HCO3–+ HS–+ H2O

(ΔGθ’= –16 kJ·mol–1CH4) (1)

尽管SAMO反应释放的能量极低(△Gθ’=–16 kJ·mol–1CH4), 但由于硫酸盐-甲烷转换带(Sulfate- methane transition zone, SMTZ)中富含硫酸盐和甲烷, 是SAMO 发生的良好环境, 所以在SMTZ 中SAMO非常普遍。SAMO 是最先发现的甲烷厌氧氧化途径, 研究得也最深入。针对海洋环境尤其是深海沉积物中的AOM已有较多研究, 研究者们通过现代分子微生物学和地球化学交叉的研究手段, 揭示了SAMO过程的调控机理, 提出了的反应机制模型[5]。

1.1 SAMO参与微生物

参与SAMO 反应的甲烷厌氧氧化古菌(ANME)根据系统发育分析, 通常可分为三类: ANME-1、ANME-2、ANME-3, 均属于广古菌门[4]。SAMO系统中的SRB一般属于脱硫八叠球菌属(), 典型形状为球状、短杆状、弧状[5]。陈颖在研究与ANME-2形成细胞团的SRB时发现该类细菌是一类自养型微生物, 基因层面上显示它是通过还原型乙酰辅酶来固定二氧化碳, 还原型乙酰辅酶A途径是一个相对较简单的途径, 即两个二氧化碳直接以非环化的方式合成乙酰辅酶A[6]。

之前人们普遍认为在SAMO 反应中, 甲烷厌氧氧化古菌(ANME)往往与硫酸盐还原细菌(SRB)形成共生体, 古菌在中央, 硫酸盐还原菌在周围, 因此甲烷氧化的同时伴随着硫酸盐的还原[7]。随着进一步的研究, 越来越多的证据表明与ANME 共生的细菌可能不仅限于SRB, 而且具有较高的多样性[8]。例如, Orphan等发现仅仅由ANME-2 细胞就可形成单一类型微生物的共生体[8]; ANME-2a能与、以及共生[6]; ANME-3古菌能与ANME-2a /( DSS) 共生[8]。但这些共生现象目前为止只是通过实验观测到的, 具体共生体的代谢方式与机理仍需通过深入的基因组分析来解答。

1.2 SAMO反应机理

目前, 已有三种理论模型用于解释SAMO的反应机理, 即: 反向产甲烷理论、乙酸化理论以及甲基化理论[4]。

Hallam在2004年发表的论文中提出了反向产甲烷模型, 依据是ANME古菌的基因组中除了缺少参与甲基和亚甲基氧化还原反应的Mer基因外, 包含了几乎所有产甲烷过程所需的基因[9]。但也有研究者对反向产甲烷理论提出了质疑, 例如: 反向产甲烷的理想条件应该是低H2浓度但Moran利用13C标记的CH4研究不同H2分压下AMO的反应速率, 发现增加H2分压对AOM的影响作用微乎其微。这也就说明H2在AOM过程中并非起中间体作用[10]。而且大部分产甲烷八叠球菌目的古菌在产甲烷过程中只能利用乙酸和甲基化合物, 并不能利用H2, 这一现象与反向产甲烷理论矛盾[5]。

基于上述问题的思考, Valentine 和Reeburgh[11]提出了SAMO 发生的乙酸化理论模型。该模型包括两种乙酸化模型。第一类: ANME 能够将两分子的甲烷氧化生成乙酸和H2(式(2)) , 产生的乙酸和H2被SRB 利用(式(3) 和式(4)) 。结合三个反应式, 可得到SAMO 的净反应式(式(5)) 。

2CH4+ 2H2O→CH3COOH + 4H2(2)

4H2+ SO2- 4 + H+→HS–+ 4H2O (3)

CH3COOH + SO2- 4→2 HCO3–+ HS–+ H+(4)

2CH4+ SO2- 4→2 HCO3–+HS–+ 2H2O (5)

另一种代谢途径则是ANME 利用CO2和甲烷生成乙酸(式(6) ) , 随后再被SRB 利用(式(7))。

CH4+ HCO3–→CH3COO–+ H2O (6)

CH3COO–+ SO2– 4→HCO3–+ HS–(7)

尽管目前没有充足的证据证明SAMO中确实存在乙酸化途径, 但它却解释了反向产甲烷理论中存在的问题[5]。

Moran[10]提出的甲基化理论是ANME以及CO2还原古菌将通过甲烷氧化产生的甲基硫化物(式(8))传输到SRB中, 其中甲烷氧化为CO2还原提供电子受体(式(9))。CO可代替甲烷为CO2的氧化提供电子受体, 从而继续甲基化反应。硫酸盐在SRB作用下, 还原生成HCO3–和HS–,这两种产物可用于甲烷氧化, 产生的H3CSH 又可作为SRB 的基质(式(10))。

CH4+1/3 HCO3–+ 5/3H++ 4/3HS–→4/3H3CSH +H2O (8)

4 /3 H3CSH + SO2- 4→4 /3 HCO3–+ 7 /3 HS–+5 /3 H+(9)

CO+1/3 HS–+1/3H2O+1/3 H+→1/3H3CSH +2/ 3CO2(10)

除了以上三种理论模型, 也有研究者认为, 不同的ANME类群可能采用的AOM机制是不同的。例如, 陈颖[6]发现ANME-2a的基因组中包含有一套经典的完整七步甲烷产生途径所需的基因, 并且转录组分析显示这些基因都是活跃表达的, 这其中包括了两套先前报道在ANME-1中缺失的Mer基因以及两套编码四氢甲烷蝶呤S-甲基转移酶, 这是第一次在甲烷代谢古菌(包含甲烷产生菌)中发现同时存在两套Mtr与Mer基因。该研究认为ANME-2a的氧化甲烷可能采用逆向甲烷产生途径的假说, 并且研究结果表明不同氧化古菌(ANME-1, ANME-2)采用了不同的甲烷氧化代谢途径。

而最新的研究发现了一种新的代谢途径, 研究证明零价硫可以作为ANME和SRB的中间物质, 即与ANME-2共生的SRB获取能量的方式是零价硫的歧化反应。因为研究者发现, ANME-2能够同化溶解的无机碳、催化甲烷厌氧氧化并且将硫酸盐还原成零价硫甚至硫化物, 而属于/(DSS)类群的SRB则通过歧化反应利用二氧化硫生成硫酸盐和负二价硫, 与此同时进行碳的固定。因此两者在一定条件下可分别独自生存而不需要依赖共生关系[6]。

1.3 SAMO过程的实际应用

很多污水中含有大量的硫酸盐, 如垃圾渗滤液、食品和医药生产废水、矿山废水等。可以利用含硫酸盐的废水处理含甲烷的废气, 是废气与废水协同处理的一个有效途径[12]。此外在废水与污泥的厌氧处理中常含有大量H2S等恶臭物质, 可将H2S氧化生成硫酸盐, 硫酸盐作为氧化剂, 将CH4氧化为二氧化碳, 实现CH4与恶臭物质硫化氢的同步去除[13]。

李琳等[14]发明了用于实现甲烷废气与含硫含氮废水协同有效地处理的膜生物处理设备。在该设备的环流式氧化容器中甲烷被氧化, 硫酸盐被还原; 气体膜组件的分离作用使未及时氧化的甲烷回流至环流式氧化容器继续被氧化,硫酸盐还原产物硫化氢进入升流式再生容器被硝酸盐氧化为硫酸盐,成为再生的氧化剂,同时硝酸盐被还原为氮气,实现甲烷废气与含硫含氮废水在两个生化反应区协同有效地处理。Auguet等[15]在研究处理含有大量H2S和CH4的下水管道废水时, 向其中加入NO2–, H2S几乎全部被氧化,包括41%的溶解性SO2- 4以及附着在生物膜上的单质硫、硫代硫酸盐和亚硫酸盐。与此同时, 有78%的甲烷被氧化, 并且在停止加入NO2–后甲烷氧化并没有立即消失。这可能是甲烷与废水中溶解性SO2- 4发生了SAMO。

除了去除污水中的硫酸盐与硫化氢, SAMO反应还能去除污水中的硫代硫酸盐, Cassarini等[16]在以聚氨酯塑料泡沫为载体的生物滴滤池反应器中, 利用甲烷为唯一电子受体, 去除硫代硫酸盐。硫代硫酸盐首先通过歧化作用分解成硫酸盐与硫化物, 然后硫酸盐与甲烷发生SAMO反应, 该反应中硫酸盐的还原速率达到0.38 mmol·L–1·d–1。并且成功富集到了SRB相关微生物。

SAMO作用在垃圾填埋场内及其渗滤液羽状体中均可发生, 可以形成自生碳酸盐和硫化物等沉积物。因此, AOM作用是垃圾填埋场甲烷减排的重要途径之一[17]。J Dong等[18]收集研究了位于中国东北的金钱堡垃圾填埋场的不同填埋年龄的多个垃圾样品, 并通过高通量测序法在样品中监测到了甲烷微菌科以及甲烷八叠球菌以及硫酸盐还原菌等ANME相关菌。该研究结果也证明了SAMO在垃圾填埋场的甲烷厌氧氧化的重要地位。

2 以NO2– /NO3–为最终电子受体的反硝化型甲烷厌氧氧化(DAMO)

根据热力学定律, NO2–/NO3–比SO2– 4更适于充当甲烷氧化的电子受体。反硝化型甲烷厌氧氧化(Denitrifying anaerobic methane oxidation, DAMO)的化学方程式可以表述为[5]:

5CH4+8NO3–+8H+→5CO2+4N2+14H2O (11)

(ΔGθ’= –765kJ·mol–1CH4)

3CH4+8NO2–+8H+→3CO2+4N2+10H2O (12)

(ΔGθ’= –928kJ·mol–1CH4)

2.1 DAMO参与微生物

参与DAMO 过程中的两种主要功能微生物包括()细菌与()古菌。2006 年, Raghoebarsing等在实验室条件下获得了能够利用亚硝酸盐为电子受体的甲烷氧化微生物富集培养物, 证实了甲烷氧化可耦合亚硝酸盐的还原。该生物过程被称之为亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化( Nitrite-dependent anaerobic methane oxidation, N-DAMO)。16SrRNA的系统发育表明该细菌属于非培养的、只能通过环境基因序列定义的新亚门—NC10门细菌。Ettwig等将此类新发现的微生物命名为()[5]。

通过对“”菌全基因序列的组装分析发现, 该菌含有pmoCBA基因编码的甲烷单加氧酶, 甲烷单加氧酶可催化完成该菌在厌氧环境中代谢。近年来, 随着pmoA基因的特异性引物的开发,菌被发现广泛存在于湖泊底泥、河流沉积物、泥炭、水稻田、湿地、土壤等各种自然生态环境中[19,20,21]。Yang等[19]研究了中国华南地区的惠州市的五片湿地中NC10门细菌种群结构时, 发现湿地植被类型以及湿地深度是影响NC10门细菌种群结构的重要因素。同样的, Shen[20]在研究土壤环境中的NC10门细菌时也发现土壤深度是影响NC10门细菌分布以及多样性的重要因素。Shen等[21]还研究了水库沉积物、池塘沉积物、湿地沉积物以及水稻田土壤中NC10门细菌的菌落结构, 发现在这四个栖息地中, NC10门细菌的菌落结构有着巨大差异。其中铵含量与有机碳含量是影响该菌菌落结构的最重要的环境因素。

随着研究的进一步深入, 研究者还在中国南海等海水环境中发现了菌的存在, 并且在实验室20 g NaCL/L的培养环境中培养90 d后检测到了该细菌的存在, 尽管其活性很低[22]。所以菌可以在有一定含盐量的环境下生长, 而非之前认为的只能生长在淡水环境中。Padilla等[23]在墨西哥北部和哥斯达黎加以外含氧量最小的海域(OMZ)中, 检测到了NC10门的细菌, 并且在亚硝酸盐和甲烷浓度升高的缺氧区丰度最高。这也说明了NC10门的细菌对于OMZ地区的氮、氧、甲烷的循环起着一定作用。

古菌()也是参与DAMO过程的一类微生物。在2013 年, Mohamed 等富集培养到一个可催化DAMO 反应的ANME-2d的单个种群, 将该古菌群命名为(), 归属于Methanoperedens科, 它是一种直径为1—3 μm 的不规则球菌, 通常以类似八叠球菌的族群方式存在, 即在中温(22—35℃)、pH 7.0—8.0 条件下生长[24]。

2.2 DAMO反应机理

DAMO反应机理可分为细菌通过内部好氧机制耦合亚硝酸盐还原与甲烷的厌氧氧化, 以及古菌通过逆向产甲烷途径耦合硝酸盐还原与甲烷的厌氧氧化[5,14]。

Ettwig等利用宏基因组方法对进行研究时发现细菌具有一套完整的甲烷好氧氧化途径酶系的编码基因, 即含有编码Nar(催化NO3–还原成NO2–的酶)、Nir(催化NO2–还原成NO的酶)、Nor(催化NO还原成N2O的酶)的基因。然而缺少N2O还原酶的编码基因。所以Ettwig等认为细菌是通过一种全新的机制进行脱氮, 即NO 被未知的NO 歧化酶(nitricoxide dismutase, nod)分解为N2和O2[25]。其中一部分的O2(3/4) 用于甲烷氧化, 剩余的氧气用于其他活动, 即被膜结合型bo类终末氧化酶利用。这也是地球上第四种生物产氧途径[6]。Ananda等[26]发现现早在大氧化时代(GOE)之前, nod便可为对血红素铜氧化酶具有低亲和力的微生物提供局部生物可利用的氧作为其底物。说明nod是一种古老的酶。nod基因被认为是生物所特有, 该基因可以作为研究不同生态系统中的生物标记物。Ananda等利用以及含有nod- like基因的微生物的宏基因组文库, 成功设计出了nod基因的靶向引物。为利用nod作为标记物追踪DAMO现象提供了可能。

当然, 在脱氮过程中起作用的并非只有甲烷氧化菌一种生物, 还存在着其他异养反硝化菌与之共同作用。在氧化途径中, 甲醇脱氢酶(MDH)是一种重要的酶, 它可将甲醇氧化成甲醛。而吡咯喹啉醌(PQQ)是MDH必不可少的辅助因子。PQQ生物合成需要两个基因组的表达, 即pqqABCDE和pqqEF。然而体内只存在pqqE与pqqF两种基因而缺乏合成PQQ的其他基因。而其他异养反硝化菌的作用就是为提供PQQ或类似生长因子。因此N-DAMO反应是建立在甲烷氧化菌以及异养反硝化菌的共同作用之上, 两类菌对此反应过程都有着重要影响[27]。

2013 年, Mohamed 等研究了古菌在DAMO 过程中所发挥的重要作用, 利用宏基因组学、宏转录组学和单细胞基因组学等分子技术结合C-12、N- 15的同位素标记实验, 发现在的基因库中, 包含产甲烷途径所需的全部基因, 包括甲基辅酶M 还原酶编码基因( McrABCDG) 以及辅酶F420型甲基辅酶M转移酶编码基因( Mer)。甲烷氧化为二氧化碳所需要的全部基因也都高度表达。此外,含有NO3–还原酶编码基因, 但是并未在细胞内检测到参与反硝化后续步骤的相关编码基因。因此只能完成将NO3–还原成NO2–的部分反硝化[28]。不过最近Ettwing等对富集到的AAA (AOM-asso­cia­ted archaea, 属于ANME-2d, 基因组分析与有95%相似性)的进行基因组分析时, 发现其基因组中含有将硝酸盐还原成亚硝酸盐以及将亚硝酸盐还原成NH4+的基因, 这结果说明AAA很有可能发生将硝酸盐还原成NH4+耦合甲烷厌氧氧化的反应。拥有这种特质的古菌非常少见。同时, AAA还能与以及Anammox菌共同生存, 并为它们提供NO2–, 实现污水中氮的去除[1]。

甲烷产生途径中最后一步催化产生甲烷的酶甲基辅酶M还原酶(Mcr)是一个包含镍离子的酶, 在逆向甲烷产生途径中Mcr的同系物被认为催化甲烷氧化的第一步反应[6]。McrA基因是比16S rRNA基因更具特异性的产甲烷菌与ANMEs的生物标记物。研究者开发了两个新型McrA引物对可以特异性识别。第一个引物对186-bp的片段可以对进行量化。另一个引物对1191- bp的扩增子可以对的系统发育进行更精细的分析。这两种引物的发现将有助于我们研究自然生态系统中的分布与丰度[29]。

2.3 DAMO过程的实际应用

DAMO的发现为处理含氮废水提供了新方法。可以利用污水厂厌氧过程产生的甲烷作为反硝化过程中的电子供体, 既节约成本, 又可减少温室气体的排放[5]。

由于DAMO脱氮工艺仅能处理NO2–、NO3–, 考虑到实际污水中还存在NH4+, Shi等[30]提出了利用DAMO功能菌与Anammox功能菌共同作用进行脱氮,古菌利用CH4作为电子供体, 将NO3–还原成NO2–, 而细菌则和Anammox细菌共同作用, 利用CH4和NH4+作为电子供体, 将NO2–还原。Shi[31]等在实验室建立了微孔膜曝气膜反应器(MBfR), 该反应器的生物膜由DAMO功能菌以及Anammox细菌共同组成, 通过逐渐增加反应器中NO3–与NH4+的负荷, 在反应的453 d后达到了684±10 mg N/(L·d)的硝酸盐去除率, 该去除率在迄今为止报道的关于DAMO反应器中硝酸盐的去除率中是最高的。

N-DAMO功能细菌(以亚硝酸盐为电子受体进行甲烷厌氧氧化的细菌)生长缓慢倍增时间长达数周甚至数月, 且代谢活性较低。针对这个问题, 国内外多个课题组研究了反应器构型, 微量元素, 电辅助手段等对N-DAMO过程的影响[32]。

传统实验室研究中, 甲烷的低传质效率, 一定程度上限制了对DAMO的研究。中空纤维膜可以增加甲烷的传质性能。钱祝胜等[35]利用中空纤维膜反应器(HfMBR)的菌群富集快速启动了DAMO过程(<3个月), 且在一定程度上提高了反硝化速率。Fu等[34]也在研究HfMBR中DAMO与Anammox的共同作用时得到了NO3–-N 85.33 mg·L·d–1的去除率和NH4+-N 37.95 mg·L·d–1的去除率。HfMBR能显着提高DAMO和Anammox的除氮率。He[35]等对痕量金属浓度的变化对N-DAMO功能细菌的生长进行研究, 结果表明Fe2+与Cu2+(浓度分别为20 μmol·L与10 μmol·L)可以促进N-DAMO功能细菌的增长并促进其活性。该研究还发现了迄今为止第一个N- DAMO功能菌的大型聚集体(10—50 μm)。关于电场刺激对细胞生长、代谢的影响已有不少研究。范秋香等[36]研究了电场对DAMO功能微生物的作用。实验证明施加电场对该DAMO功能微生物的活性具有促进作用。并且不同的电压强度对DAMO的促进程度也不同。在施加电压为1V时, DAMO功能微生物活性最强。

有研究者对污水厂利用DAMO技术的经济效应进行了分析。假设污水厂的人口当量数为500000 (处理水量100000 m3·d-1), 如果污水厂不采用污泥厌氧消化技术(不采用该技术的污水厂占中国污水厂数的80%以上), 那么该污水厂每天的运行费用在60000—80000, 其中有40000用于处理剩余污泥。但污水厂若采用活性污泥法与DAMO相结合的技术, 那么该污水厂可以节省20000外加有机碳源的费用, 同时可产生5000 kWh电能, 并且回收近3 t的鸟粪石[37]。

DAMO除了在污水处理中有着广泛应用, 对于降解垃圾填埋场污染物也起着重要作用。柳蓉[38]等通过静态培养试验, 分析了电子受体SO2-4共存条件下, NO3–和CH4共存对覆土中苯系物厌氧降解的影响。结果表明不外加NO3–时, 苯系物抑制CH4的降解, 单独添加NO3–或CH4都能促进填埋覆土中苯系物的去除; 而同时添加NO3–和CH4能更好地促进苯系物的去除, 甲苯、二甲苯和异丙苯的去除率最高可达65%、88% 和82%。所以NO3–还原耦合甲烷厌氧氧化过程能同步促进具有“三致性”的苯系物的厌氧氧化。

总之, DAMO工艺不仅具有显著的经济环境效益, 在污水脱氮等领域存在的潜力也不容小觑, 值得进行更深入的研究。

以Fe3+、Mn4+、Cr5+、MnO4-等金属离子为电子受体的甲烷厌氧氧化(metal-AOM)

Fe3+、Mn4+、Cr5+、MnO4—等电子离子是除了SO2- 4与NO2–/NO3–外第三类参与AOM过程的电子受体。该过程被称为金属离子耦合甲烷厌氧氧化(metal-AOM)[2]。在地球处于还原性大气的时期, 甲烷营养型生物只能进行无氧呼吸, Mn4+、Fe3+便成为它们进行无氧呼吸获取能量的重要的电子受体。根据Mn4+, Fe3+的柱状综合光氧化速率(分别为5mg ·(cm2· a)-1和200 mg·(cm2·a)-1) , 早期地球上依赖Mn和Fe 发生的AOM 氧化的甲烷的数量级可以达到10000 Tg ·a-1。说明依赖Mn和Fe 的AOM 作用有足够的氧化能力消耗地球早期的甲烷通量[8]。其反应方程式为[39]:

CH4+8Fe(OH)3+15H+→HCO3–+ 8Fe2++21 H2O

(ΔGθ’= –572.15kJ·mol-1CH4) (13)

CH4+4MnO2+7H+→HCO3–+ 4Mn2++5 H2O

(ΔGθ’= –789.91kJ·mol-1CH4) (14)

3.1 参与metal-AOM的微生物

2009年, Beal等发现在加利福尼亚Eel River流域的海洋沉积物中的微生物可以分别实现甲烷厌氧氧化耦合Fe3+、Mn4+的还原, 为AOM开拓了新的领域[40]。随后, 不断有研究者利用地球化学分析法与同位素示踪法, 在富铁的丹麦日德兰半岛Ørn湖和西伯利亚Baikal湖的沉积物、印度尼西亚的Matano湖、伯米吉州附近原油污染污染水域以及台湾东部陆地泥火山中, 发现了甲烷厌氧氧化耦合金属离子还原现象[39,43,47,49,50]。最近, Peng等[41]在冲绳海槽北部的海底碳酸盐沉淀中检测到了大量的自生黄铁矿, 以及痕量Fe, 这也是第一个Fe3+还原耦合甲烷厌氧氧化的化石实例。除了在海洋沉积物中, Egger等[42]在沿海地区的表层沉积物中也发现了Fe3+还原耦合甲烷厌氧氧化, 并且由于该反应产物Fe3+可以原位利用磷元素形成磷酸亚铁矿物, 对于沿海地区的富营养化有着削弱作用。

尽管许多研究者观测到了自然界存在的甲烷厌氧氧化耦合金属离子还原的现象, 但真正通过实验室培养微生物从而实现甲烷厌氧氧化耦合金属离子还原反应的报道并不多。在为数不多的实验报道中, 我们发现, 属于甲烷厌氧氧化古菌的ANME-2及其亚类ANME-2a、ANME-2c、ANME-2d(也称为AAA, 前文已有介绍)均可参与该反应[1,44]。各亚类之间进化距离相距较远, ANME-2d与其他成员的同源性较远[4], 并且被一度认为不具备氧化甲烷的能力。Chang 等[43]在台湾东部泥火山的孔隙水中研究metal-AOM反应时, 发现包括ANME-1、ANME-2、ANME-3在内的几乎所有ANME的亚类都可参与金属离子耦合AOM反应。

Lu等[45]利用CH4作为唯一电子供体来研究Cr5+的还原。在间歇式反应系统中观察到了Cr5+耦合甲烷厌氧氧化的反应。通过16SrRNA基因测序观察Cr5+还原后微生物群落的变化。ANME-2的古菌数量大大增加, 并且成为与AOM反应相关的唯一优势种群。所以研究者猜测该反应的完成有两种可能, 即由ANME-2单独完成或是ANME-2耦联其他未知的Cr5+还原菌完成。因为其他有着显著数量增加的微生物(如红球菌和甲烷八叠球菌), 从未有过它们拥有还原Cr5+能力的报道。

Scheller等[44]发现在对含有ANME-2古菌(包括ANME-2a与ANME-2C)的培养基中分别加入AQDS(一种人造电子受体)、腐殖酸、以及铁的配合物(柠檬酸铁和乙二胺四乙酸铁)时均可发生甲烷厌氧氧化现象。主要原因是ANME-2古菌细胞膜表面含有大量血红素c蛋白质, 该蛋白质可以使AQDS以及Fe3+等体外电子受体接受来自古菌体内通过反向产甲烷途径产生的电子, 也就是说, AQDS以及Fe3+等体外电子受体充当了SAMO反应中SRB的角色。

Ettwing等[1]在厌氧并且持续通入甲烷的环境中, 从发生硝酸盐耦合甲烷厌氧氧化的培养基中成功富集到了AAA, 并向利用其作为唯一金属氧化菌的淡水富集培养基中通入13C标记的甲烷, 并且证明溶解态的Fe3+(柠檬酸铁)以及纳米颗粒态的Fe3+、Mn4+均支持甲烷厌氧氧化反应。并且对AAA基因型进行分析, AAA含有反向产甲烷所需的全部基因。并且含有大量编码血红素c蛋白质的基因。

3.2 金属离子耦合甲烷厌氧氧化的反应机理

对于metal-AOM的反应机理目前还不是很明确, 目前根据研究所得可能的机制有三种, 第一种认为通过一种或几种微生物使得金属离子直接耦合甲烷厌氧氧化, 即类似于硫酸盐还原耦合甲烷厌氧氧化机制[46]。

第二种是在硫化物存在条件下, 形成零价硫, 反应方程如下(以FeS为例)[47]。零价硫通过零价硫的歧化反应生成硫酸盐和负二价硫, 与此同时进行碳的固定。产生的硫酸盐可以与甲烷发生SAMO,从而氧化甲烷[48]。

Fe(OH)3+FeS+6H+→3Fe2++ S0+6 H2O (15)

第三种(以Fe3+耦合甲烷厌氧氧化为例)是反应体系中的H2被三价Fe还原菌利用至低浓度后, 通过反向产甲烷作用, 氧化甲烷[48]。

3.3 金属离子耦合甲烷厌氧氧化的研究意义

金属离子耦合甲烷厌氧氧化对于减少全球甲烷的排放量有重要意义。例如, 在海洋生态系统中, metal-AOM反应经常发生在硫酸盐—甲烷转换带(SMTZ)以下的位置, 由于人为引起的海洋富营养化以及SMTZ带上移等因素导致金属氧化物经常被埋在还原区域以下, 在该区域中, NO2–、NO3–以及SO2– 4的含量十分有限, 金属很有可能成为在该海洋深度中唯一可以氧化甲烷的电子受体[2]。除此之外, 在对metal-AOM反应中最常见的三价铁还原耦合甲烷厌氧氧化(Fe-AOM)的研究中发现, 如果Fe-AOM氧化的甲烷量可以占到全球甲烷氧化量的10%, 那么排放到空气中的甲烷的减少量会是现在的两倍[46]。

Metal-AOM反应对全球碳元素、硫元素、磷元素以及金属元素的循环有着重要影响。Fe2+、Mn2+以及CO2等Metal-AOM的反应产物可以与其他金属以及硫、磷元素等通过地质作用形成矿物。例如Fe2+可以与磷元素、硫元素、碳酸盐以及残余Fe3+的一起, 生成蓝铁矿、黄铁矿、菱铁矿、磁铁矿等矿物[2]。除此之外, Fe-AOM过程中还可以去除环境中的污染物, 例如在含水层中, 苯、乙苯等碳氢化合物经常与三价铁一起沉淀, 通过Fe-AOM可以降解这些有毒有害物质[49]。

4 展望

对于目前已发现的甲烷厌氧氧化过程, SAMO、DAMO以及以Fe3 +、Mn4 +等高价离子为电子受体的甲烷厌氧氧化, 其反应机理和代谢途径以及与实际工程相结合的应用仍处于初步研究阶段, 仍有许多问题需要研究。

对甲烷厌氧氧化过程和机理的进一步研究, 有助于深入了解和认识自然界的物质循环过程。硫酸盐型甲烷厌氧氧化的发现改变了我们对海洋环境碳、氮、硫循环的认识。而新近研究的Fe3+、Mn4+等金属离子为电子受体的甲烷厌氧氧化过程, 增加了我们所知的自然界甲烷厌氧氧化类型。AAA被发现可以单独完成甲烷厌氧氧化耦合金属电子受体的还原, 但其将电子从细胞内传递至金属受体内的机理仍需更深入的研究。AAA对于甲烷的减排起着至关重要的作用, 对AAA的研究将会对地球早期以及现在的铁、锰、硫、磷甚至是碳元素的循环有重要影响。

由于人类活动的影响, 自然环境中的甲烷厌氧氧化过程也发生变化。由于沿海环境中的人为氮污染, 导致该环境含有大量的NO2–与NO3–, 所以沿海环境沉积物中往往会有DAMO发生, 甚至连深海沉积物中都有DAMO的发生。DAMO功能菌的在自然界中的分布, 种群的多样性以及群落结构仍需进一步研究, 尤其是人为活动影响的生态系统中。

对甲烷厌氧氧化过程的发现和研究也为环境污染控制提供了新的技术。DAMO是处理含氮废水的新方法, 是污水厂寻找节能减排, 可持续发展的新出路。DAMO耦合厌氧氨氧化(Anammox)处理含氮废水已有实际运行工艺方面的初步研究, 但是DAMO功能菌生长缓慢限制了其实际应用。同时, DAMO及脱氮过程是建立在甲烷氧化菌以及异养反硝化菌的共同作用之上, 所以进一步研究这两类菌的共同作用, 对提高反应速率会有很大帮助。

垃圾填埋场中普遍存在着缺氧区, 甲烷的厌氧氧化对于垃圾填埋场的甲烷排放通量会有一定的影响, 而现在对垃圾在填埋场稳定化过程中的甲烷厌氧氧化活动研究很少。因此深入研究填埋场内部厌氧氧化的微生物机制、参与该过程的微生物群落, 以及影响氧化速率的因素(如微生物生长量、底物、温度、pH 以及湿度等), 将有助于全面理解填埋场内部的碳转化过程, 为有效地调控垃圾填埋场的甲烷排放通量提供依据。

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Research progress on microbial mechanism and application of anaerobic oxidation of methane

WU Yining1, MEI Juan1,2,3*, SHEN Yaoliang1,2,3

1. School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China 2. Jiangsu Key Laboratory of Environmental Science and Engineering, Suzhou 215009, China 3. Jiangsu High Education Collaborative Innovation Center of Water Treatment Technology and Material, Suzhou 215009, China

Methane is a significant greenhouse gas, and anaerobic oxidation of methane (AOM) is important to mitigate the global methane emissions to atmosphere. There are three kinds of terminal electron acceptors involved in AOM processes: SO2– 4, NO2–/ NO3–and oxidized metals such as Fe3+, Cr5+. Based on microbial genotype analysis, the mechanisms, involved microorganisms and the intracellular metabolic pathway of three different kinds of AOM processes were summarized. Especially, the study of AAA(AOM-associated archaea, belonging to ANME-2d), which could couple the reduction of NO3–, Fe3+and Cr5+to the oxidation of methane is critical for understanding the mechanisms of AOM, and researches on its separation and cultivation is important for the practical application of AOM. The latest research progresses of engineering applications of AOM in the field of environmental pollution control were also introduced, and the significance of AOM process in energy-saving and emission reduction was discussed. Further researches on the mechanisms of AOM are helpful for better understanding of the biogeochemical cycle of carbon, nitrogen and sulfur, and can promote more practical application of AOM.

aerobic methane oxidation; electron acceptors; anaerobic methanotrophic archaea; environmental pollution control

10.14108/j.cnki.1008-8873.2018.04.029

A

1008-8873(2018)04-231-10

2017-8-2;

2017-11-30

国家自然科学基金(No.51508367); 江苏省自然科学基金项目(No.BK20140282)

吴忆宁(1993—), 女, 硕士, 主要从事环境工程专业. E-mail:953663455@qq.com.

梅娟. E-mail:susie_mei@163.com

吴忆宁, 梅娟, 沈耀良. 甲烷厌氧氧化机理及其应用研究进展[J]. 生态科学, 2018, 37(4): 231-240.

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