miRNA-203联合TSGF、CEA检测在胃癌诊断中的应用

殷立奎，徐广晓，朱新兴，李守勇

(山东省东营市人民医院：1.检验科；2.手术室 257091)

胃癌的发病率与病死率在全球范围内居于第3位，表现为三高(发病率高、复发转移率高、病死率高)与三低(早诊率低、根治切除率低、5年生存率低)的特点，成为最为常见的消化道恶性肿瘤[1-2]。胃癌的发现及治疗效果，均可以通过肿瘤标志物(TM)来快速诊断。随着细胞分子生物学的进步，TM的检测使早发现、早诊断肿瘤成为了可能。血清TM的异常通常早于影像学。胃癌早期患者无明显的临床症状，任何一项特异和敏感的TM出现异常都有一定指导价值[3-4]。但单一TM检测对胃癌诊断存在一定的局限性。故本文针对性地选择肿瘤生长因子(TSGF)、微小核糖核酸(miRNA)-203、癌胚抗原(CEA)3种具有较高特异度与敏感度的TM来检测胃癌患者与健康人群血清中的表达情况，通过比较3种TM对胃癌检测及预后的诊断价值，以期为临床提供一定的参考指标。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年7月至2016年7月来本院就诊的胃癌患者40例纳入观察组，以上患者均未进行放化疗与免疫治疗，且经病理学检查证实。观察组男23例，女17例；平均年龄(48.37±4.78)岁；依据2010版国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会(IUICC/AJCC)制定的肿瘤(TNM)分期标准，分为Ⅰ～Ⅳ期，其中Ⅰ期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例。同时选择同期健康志愿者30例为对照组，男20例，女10例，平均年龄(46.79±5.46)岁。两组研究对象性别、年龄等一般性资料对比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2仪器与试剂 仪器为德国罗氏公司生产的全自动电化学发光免疫分析仪E-170，测定试剂盒及质控品为仪器配套；日本Hitachi公司生产的全自动生化分析仪7080；湖南新大陆公司生产TSGF、CEA定量测定试剂盒与质控品。

1.3方法 单核细胞分离提取：采集研究对象2 mL空腹静脉血(采入乙二胺四乙酸抗凝管)，3 h后使用Ficoll液分离，洗涤离心5次，弃上清液，保存于-80 ℃冰箱中备用。血浆RNA提取：依照Trizol试剂盒标准严格实施每一步，经所得RNA A260/280调节在1.8～2.1。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)：依照Access RT-PCR System严格操作，并依据GenBank设计对应序列引物(a为正义引物，b为反义引物)：miR-203-Fa GTG AAA TGT TTA GGA CCA CTA GAA，miR-203-Rb GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT，U6 RNA-Fa CGC TTC GGC AGC ACA TAT AC，U6 RNA-Rb TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT。其中，总反应体系为50 μL：28 μL 无核酸酶水，10 μL AMV /Tfl 5X反应缓冲液，1 μL dNTP混合液(10 mmol/ L)，1 μL下游引物，1 μL 上游引物，2 μL 25 mmol/L硫酸镁，1 μL AMV反转录酶，1 μL Tfl DNA聚合物，5 μL RNA。反应条件： 45 ℃ 45 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，68 ℃ 2 min，68 ℃ 7 min，4 ℃ ∞。以上循环进行40次。血清CEA水平、miRNA-203相对表达量、TSGF水平检测均严格按照操作说明书进行。参考值CEA为0.00～5.00 ng/mL，TSGF为0.00～64.00 U/mL。

2 结 果

2.1miRNA-203相对表达量，TSGF、CEA表达水平及阳性率比较 观察组患者miRNA-203相对表达量为(0.26±0.16)U/mL,明显低于对照组(P<0.05)；观察组TSGF、CEA表达水平及阳性率明显高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2不同分期胃癌患者miRNA-203相对表达量，TSGF、CEA表达水平及阳性率比较 miRNA-203相对表达量随分期递增而降低(F=5.60，P=0.007 5)。TSGF、CEA表达水平及阳性率随分期递增而增加，不同分期的TSGF、CEA水平差异有统计学意义(P<0.05)；不同分期CEA阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)，而不同分期TSGF阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 两组miRNA-203相对表达量，TSGF、CEA表达水平及阳性率比较

2.3miRNA-203、TSGF、CEA对胃癌患者的诊断价值 miRNA-203+TSGF+CEA检测的敏感度为95.00%，明显高于miRNA-203、TSGF、CEA单项或者miRNA-203+CEA、TSGF+CEA、miRNA-203+CEA的敏感度，差异有统计学意义(P<0.05)；miRNA-203+TSGF+CEA检测的诊断符合率为97.50%，特异度为90.00%，优于单项或者两项指标联合检测结果(P<0.05)。见表3。

表2 不同分期胃癌患者miRNA-203相对表达量，TSGF、CEA表达水平及阳性率比较

表3 miRNA-203、TSGF、CEA对胃癌患者的诊断价值比较[(%)n/n]

3 讨 论

胃癌是恶性肿瘤中最为常见的一种，其发病率在不同地区和国家存在较大差异，其中芬兰、日本是高发国家，而新西兰、澳大利亚等国家的发病率较低[5]。在我国，胃癌占城市病死率的第2位，其中中南与西南地区最低，内蒙古自治区及东北较高，西北地区最高，占农村病死率的第1位。据有关调查显示，每年胃癌死亡人数约17万，与此同时每年有超过2万患者被确诊为胃癌。胃癌已经成为严重危害人类生命健康的疾病之一，也是各大医疗机构重点攻克的难题[6-7]，尽早诊治有着重要临床价值。

多数胃癌患者在发现时已经是中晚期，严重影响患者的康复。为了提高胃癌的早发现率，提高患者生存率，找到行之有效的TM极为关键。TM主要指机体对新生物发生应激反应进入到体液、组织的物质，或者是癌细胞异常分泌或脱落的物质。随着细胞基因水平的发展，胃癌患者采用TM诊断使早发现、早诊断肿瘤在临床成为可能[8]。TM检测异常血清指标变化也为临床预估患者病情程度提供了指导。不同种类的癌症其TM会产生不同类型的癌细胞，而同一种癌细胞也会产生多种TM[9]。

近年来，临床较多把TM用来检测多种类型肿瘤，但单一TM检测存在特异度或敏感度较低的问题，故临床上逐渐采用多种TM联合检测来诊断癌症。最新研究报道显示，miRNA-203和胃癌的发生存在显著的相关性[10]。随着肿瘤患者病情的进展，血清miRNA-203出现明显的异常表达。miRNA-203为19～22碱基长度的内源性非编码RNA，几乎参与机体全部的基本信号传输路径，并调控约1/3的人类基因水平表达，对许多基因的调控发挥关键作用。同时，miRNA-203还能够调节细胞增殖、分化、凋亡及一些肿瘤相关基因表达等代谢过程[11-12]。CEA也是广谱性TM，主要成分是多糖蛋白复合物质，在内胚叶起源的胃癌、胰腺癌等消化系统肿瘤中大量存在。TSGF是与癌细胞增殖过程相关的多种糖类物质和代谢产物的总称，主要是恶性癌细胞与组织附近毛细血管发生大量增生而关联的内皮生长因子[13]。本研究结果显示，miRNA联合TSGF、CEA检测的敏感度为95.00%，明显高于miRNA-203、TSGF、CEA单项或者miRNA-203+CEA、TSGF+CEA及miRNA-203+CEA的敏感度，差异有统计学意义(P>0.05)；miRNA-203联合TSGF、CEA检测的诊断符合率为97.50%，特异度为90.00%，优于单项或者两项指标联合检测结果。这是由于CEA自身特异度低，而敏感度较高，对肿瘤早期诊断有明显辅助作用。同时TSCF为广谱血清TM，其指标变化仅对肿瘤增生有明显反应，对非恶性血管增生几乎不会出现变化，故TSGF对胃癌患者血清指标变化有明显的高度特异性。而miRNA-203可以作为特异性的TM，可以提高胃癌的准确诊断性。这也表明多种TM联合检测不仅能够增强诊断的敏感度，也对早期诊断与病情监测有指导作用，为临床胃癌诊断标准提供方向[14-15]。

在肿瘤细胞的生长进程中，miRNA-203可以调控肿瘤的发生、发展。有研究报道显示，miRNA-203可对肿瘤进行诊断、分期，不同程度的miRNA-203相对表达量和胃癌有明确联系[16]。本研究结果显示，miRNA-203相对表达量随分期递增而增加，可以推测其在胃癌诊断及转归预测中的作用。而TSGF、CEA表达水平及阳性率随分期递增而增加。大多数患者肿瘤分泌血清CEA位于胃肠道、泌尿道等空腔脏器。在一般情况下，血清CEA通过胃肠道进行代谢，发生肿瘤时，CEA会通过循环系统进入血液和淋巴中，导致机体血清CEA出现异常上升。而患者机体肿瘤的分期与CEA水平高低相一致，这就为肿瘤的诊断与病情预判提供了价值。通常，肿瘤分期越晚或发生远处转移、复发等情况，血清CEA检测的敏感度就越高。患者胃癌的预后、进展以及分化程度与血清CEA水平密切相关，同时其也和肿瘤大小、转移以及浸润情况紧密相关，故可以结合其他指标来预估胃癌患者的放化疗治疗效果。若血清CEA水平降幅大于50%，抑或低于正常水平且维持时间大于4周，可以认为治疗是有效的；若出现治疗后CEA水平持续上升，则表明预后效果不良。

进一步分析显示，胃癌患者血清miRNA-203相对表达量为(0.26±0.16)U/mL，明显低于健康人群；TSGF、CEA表达水平及阳性率明显高于健康人群。这也表明以上3种TM对于诊断胃癌有较高的特异度与敏感度，在临床检测中有较高的指导价值[17]。进一步揭示联合以上指标检测可显著提高胃癌诊断准确度，也显示多种TM联合检测具有互补性，可弥补单项TM诊断存在阳性率降低的缺点，为胃癌诊断与预后提供指导价值。

综上所述，采用miRNA-203联合TSGF、CEA检测，可以及时、准确诊断胃癌，具有较高的特异度与诊断符合率，在临床上有较高的诊断价值。

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