响应面法优化玫瑰茄粗多糖提取工艺及其抗氧化活性的研究

郑大恒, 王 未, 李 倩, 陈 瑶, 张伟杰, 赵 婷, 仰榴青*

1.绍兴文理学院生命科学学院, 浙江 绍兴 312000; 2.江苏大学食品与生物工程学院, 江苏 镇江 212013; 3.江苏大学环境与安全工程学院, 江苏 镇江 212013;4.江苏大学化学化工学院, 江苏 镇江 212013

玫瑰茄(HibiscussabdariffaL.)为锦葵科木槿属一年生草本植物，原产于东南亚、南美和非洲等热带国家和地区，目前，我国浙江、福建、云南、广东、广西等地已有大面积种植[1,2]。玫瑰茄作为传统的药食同源植物，富含多酚、花青素和类黄酮等物质，具有降血压、提高免疫力、防治心脑血管疾病以及抗肿瘤等功效[3～6]。多糖作为一种生物活性成分，近年研究发现其具有清除体内自由基、抗氧化作用[7]。

活性氧自由基如超氧阴离子自由基和羟基自由基，对人体或动物是一种必需物质，但过量的自由基可导致DNA、蛋白质和脂质的氧化损伤，大量证据表明，人类的许多疾病，如癌症、心血管疾病和神经退行性疾病，都是自由基氧化损伤的结果[8]。玫瑰茄花萼中也含有多糖，然而关于玫瑰茄多糖的研究报道却很少。

响应面分析法(response surface techodology)是利用合理的试验设计方案，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析、优化工艺参数预测响应值的一种统计方法。响应面分析法目前已成为降低成本、优化加工条件的一种有效方法，广泛地应用于农业、生物、食品、化学等领域[9]。因此，本文在单因素实验结果的基础上，以粗多糖得率为考察指标，采用响应面分析法对玫瑰茄粗多糖的提取工艺进行优化，并考察了其抗氧化活性，以期为玫瑰茄多糖的进一步研究、开发和应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玫瑰茄采自江苏省丹阳市，经镇江食品药品监督管理局鉴定为锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)玫瑰茄(HibiscussabdariffaL.)；恒温电热鼓风干燥箱(上海一恒仪器有限公司)；数控恒温水浴锅(常州华冠仪器制造有限公司)；R-200型旋转蒸发器(瑞士Büchi公司)；UV2501紫外可见光分光光度计(岛津仪器设备有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1原料预处理 取石油醚，将粉碎的玫瑰茄干花萼反复回流脱脂，抽滤，室温晾干。向脱脂后的玫瑰茄花萼粉末中加入3倍体积的75%乙醇浸泡过夜，以除去黄酮、色素、单糖等小分子物质。抽滤，晾干，得到预处理后的玫瑰茄粉末，备用。

1.2.2玫瑰茄粗多糖的提取 采用水提醇沉法提取玫瑰茄粗多糖。称取预处理后的玫瑰茄粉末5 g，置于圆底烧瓶中，按一定料液比、水浴温度、浸提时间在热水浴中回流浸提数次，冷却后将所得水提液抽滤，去除杂质，合并上清液，上清液经减压浓缩，按张斌涛等[10]的方法除去蛋白后，加入一定量无水乙醇至终浓度为80%，充分搅拌，放入4℃冰箱，静置12 h，3 000 r/min离心10 min，收集沉淀；蒸馏水复溶，于透析袋中(截留分子量3 500 Da)透析72 h，透析后的样品经冷冻干燥，即得玫瑰茄粗多糖。由以下公式计算多糖得率(Y)：

粗多糖得率(Y)= 粗多糖质量(g)/样品质量(g)×100%

1.2.3单因素实验 ①料液比单因素实验。设定固定提取时间为3 h，温度为90℃，设计料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30(g/mL)，每组实验重复3次，确定料液比对玫瑰茄粗多糖得率的影响。②提取时间单因素实验。 设定固定料液比为1∶25(g/mL)，提取温度为90℃，分别提取1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，每组实验重复3次，确定不同提取时间对玫瑰茄粗多糖得率的影响。③提取温度单因素实验。 设定固定料液比1∶25(g/mL)，提取时间为3 h，分别在60℃、70℃、80℃、90℃和100℃提取，每组实验重复3次，确定不同提取温度对玫瑰茄粗多糖得率的影响。

1.2.4响应面法优化玫瑰茄粗多糖的提取工艺 根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，综合单因素实验结果，采用3因素3水平响应面分析法对玫瑰茄中粗多糖的提取条件进行优化，并对优化条件进行验证。实验因素和水平见表1。

表1 响应面分析因素及水平表Table 1 Factors and levels used in response surface methodology.

1.2.5玫瑰茄粗多糖清除自由基能力的测定

①对DPPH自由基清除能力的测定。取玫瑰茄粗多糖，分别配制浓度为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL、1.8 mg/mL和2.0 mg/mL的多糖样品。取不同浓度的多糖样品1 mL和0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液2 mL，混匀，暗处反应30 min，于517 nm处测定吸光度值(Ai)，用蒸馏水替代样品测得的吸光度值作为A0，用乙醇替代DPPH-乙醇溶液测得的吸光度值作为Aj，按以下公式计算玫瑰茄粗多糖对DPPH自由基的清除率[11]。同时以抗坏血酸(Vc)作为阳性对照，每个样品重复3次，求平均值。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

②对羟基自由基清除能力的测定。取9 mmol/L硫酸亚铁1 mL，加入9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL，加入不同浓度(0.2～2.0 mg/mL)的多糖样品1 mL，加入8.8 mmol/L的H2O21 mL，摇匀，在37℃的恒温水浴锅中反应30 min，于波长510 nm处测定吸光光度值(Ai)，用蒸馏水替代样品测得的吸光度值作为A0，用蒸馏水替代H2O2测得的吸光度值作为Aj，按以下公式计算玫瑰茄粗多糖对羟基自由基的清除率[12]。同时以抗坏血酸(Vc)作为阳性对照，每个样品重复3次，求平均值。

羟基自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

③对超氧阴离子自由基清除能力的测定。取0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)4.5mL，25℃水浴中预热20 min，分别加入不同浓度(0.2～2.0 mg/mL)的多糖样品1.0 mL和0.4 mmol/L的邻苯三酚1.0 mL，混匀后于25℃恒温水浴锅中反应5 min，然后立即滴加2滴8 mol/L HCl终止反应，并在波长为325 nm处测定吸光光度值(Ai)，用蒸馏水替代样品测得的吸光度值作为A0，用蒸馏水替代邻苯三酚测得的吸光度值作为Aj，按以下公式计算玫瑰茄粗多糖对超氧阴离子自由基的清除率[13]。同时以抗坏血酸(Vc)作为阳性对照，每个样品重复3次，求平均值。

超氧阴离子自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.2.6数据统计 采用SPSS 20.0统计软件对实验结果进行分析，单因素方差分析组间差异的显著性，结果采用 Mean±SD 表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 各单因素对玫瑰茄粗多糖得率的影响

2.1.1料液比的影响 图1为浸提温度为90℃，浸提时间3 h时，料液比对玫瑰茄粗多糖得率的影响。在料液比低于1∶25时，玫瑰茄粗多糖的得率随料液比的增大而增加。在料液比为1∶25(g/mL)时多糖得率达到最高值，但料液比超过1∶25(g/mL)后，多糖的得率略有下降。其可能的原因是溶剂水的用量较小时，原料中的多糖不能够充分转移到水中，造成提取不完全、得率较低，水用量过大时，多糖溶出量已达到饱和，初始加水量过大会使后续浓缩工序能耗增加，因此最优料液比选择1∶25(g/mL)为宜。

图1 料液比对粗多糖得率的影响Fig.1 Effect of solid-liqiud ratio on the yield of polysaccharide.

2.1.2提取时间的影响 图2为料液比1∶25(g/mL)，提取温度90℃时提取时间对玫瑰茄粗多糖得率的影响。随着提取时间的延长玫瑰茄粗多糖得率不断增加，多糖得率在提取时间3 h时达到最大，之后随着时间的延长得率有所下降，因此，确定提取时间为3 h。

2.1.3提取温度的影响 图3为料液比1∶25，提取时间为3 h时，提取温度对玫瑰茄粗多糖得率的影响。在60～90℃温度范围内，随着提取温度的升高，玫瑰茄粗多糖得率逐渐增加，继续升温到100℃，多糖得率略有下降。因此，选择提取温度为90℃。

图2 提取时间对粗多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide.

图3 提取温度对粗多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide.

2.2 响应面法优化玫瑰茄粗多糖提取工艺

2.2.1响应面试验设计结果及方差分析 根据Box-Behnken中心组合试验原理设计17个实验，实验1～12为析因实验，13～17为中心实验。采用Design-Expert V 8.0.6软件对所得数据进行分析，结果见表3。

由表3可见，一次项X1、X3和交互项X1X2对玫瑰茄粗多糖的提取得率有显著影响，一次项X2和二次项X12、X22、X32和交互项X1X3、X2X3对玫瑰茄粗多糖的提取得率影响极显著，说明实验因子对响应值不是简单的线性关系。

表2 响应面分析因素设计及实验结果Table 2 Response surface design with experimental results.

Y=14.44+0.087X1+0.16X2+0.097X3-0.12X1X2-0.17X1X3-0.54X2X3-0.29X12-0.56X22-0.61X32。

2.2.2响应面图分析 图4(彩图见图版七)为各个因子交互作用的响应面三维图和等高线分析图。等高线图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响，圆形表示二因素交互作用不显著，椭圆表示二因素交互作用显著[14]。由图4A、B可知，当提取温度为90℃时，玫瑰茄粗多糖得率随料液比和提取时间的变化而变化，其变化幅度和曲线坡度均较大，可见料液比与提取时间两个因素对多糖得率存在着较强的交互作用。当固定提取时间为3 h时，由图4C、D可见：提取温度曲线急剧变化，可见提取温度对玫瑰茄粗多糖得率的影响较大，同时等高线也呈椭圆形，说明提取温度和料液比两个因素间的交互作用也较大。当固定料液比为1∶25时，提取温度和提取时间两个因素也存在显著的交互影响，当温度从80℃增加至90.04℃时，玫瑰茄粗多糖得率随之显著提高，而后当温度继续升高，得率有所下降，这表明玫瑰茄粗多糖得率达到最大值时，温度为90.04℃(图4E、F)。

表3 响应面方差分析结果Table 3 Analysis of variance and result.

注:*表示P<0.05水平差异显著；**表示P<0.01水平差异显著。

2.3 最优提取工艺验证

通过响应面法预测玫瑰茄粗多糖最优的提取工艺条件为最大响应值(Y)时，X1、X2、X3对应的编码值分别为：A=0.123、B=0.129、C=0.004，与其相对应的多糖的最佳提取条件是：1∶25.62(g/mL)、时间3.13 h、温度90.04℃，理论最佳提取率是14.46%。考虑到实际情况对上述条件进行修正，最终的优化条件调整为液料比1∶26(g/mL)、提取时间3.1 h、提取温度90℃，在此条件下进行3次平行实验验证，提取得率为14.41%，与理论预测值较接近，说明该响应面法优化得到的模型准确可靠，适用于玫瑰茄粗多糖的提取。

2.4 玫瑰茄粗多糖对自由基的清除作用

2.4.1对DPPH自由基的清除作用 DPPH自由基被认为是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若样品可以将其清除，则表明该样品具有抗氧化活性。DPPH有单电子，在517 nm有最大吸收，其乙醇溶液呈深紫色，当样品具有抗氧化活性时，它能与DPPH的单电子配对，从而使DPPH-乙醇溶液颜色变浅，其褪色程度与样品清除自由基效率呈线性关系，因而可用此方法评价样品的抗氧化能力[15]。由图5可知，玫瑰茄粗多糖对DPPH自由基有一定的清除作用。当多糖浓度从0.2 mg/mL 升到2.0 mg/mL时，随着多糖浓度的升高，对DPPH的清除作用也逐渐加强，当玫瑰茄粗多糖浓度为2 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率可达到45.89%。

2.4.2对羟基自由基的清除作用 羟基是一种活性氧自由基，毒性极强，可造成生物膜损伤，导致多种疾病发生，清除体内羟基自由基是保证机体健康必不可少的需求[16]。

由图6可知玫瑰茄粗多糖对羟基自由基的清除作用与多糖的浓度成正相关，当多糖浓度为0.2 mg/mL 时，对羟基自由基的清除率可达10.23%，当多糖浓度为2 mg/mL 时，对羟基自由基的清除率可达61.42%，随着玫瑰茄粗多糖浓度的增加，对羟基自由基的清除率也随之升高。

图4 液料比、提取时间和提取温度对玫瑰茄粗多糖得率的响应面(A、C、E)和等高线分析图(B、D、F)Fig.4 Response surface(A、C、E) and contour plots (B、D、F) results of solid-liquid ratio, extraction time and extraction temperature effects on the yield of polysaccharide. (彩图见图版七)

2.4.3对超氧阴离子自由基的清除作用 超氧阴离子自由基是人体内产生的一种活性氧自由基，能引发体内脂质过氧化，加快肌体的衰老，诱发癌症、心血管疾病，严重危害人体健康[17]。玫瑰茄粗多糖对超氧阴离子自由基具有一定的清除作用，如图7所示，随着粗多糖浓度的增加，清除作用逐渐增强。当多糖浓度为2 mg/mL 时，对超氧阴离子自由基的清除率达到81.42%。

图5 玫瑰茄粗多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect of polysaccharide on DPPH free radical.

图6 玫瑰茄粗多糖对羟基自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polysaccharide on hydroxyl free radical.

图7 玫瑰茄粗多糖对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polysaccharide on superoxidant free radical.

3 讨论

张文莉[18]采用水提醇沉法提取玫瑰茄干花萼中的粗多糖，提取得率为9.78%；Müller等[19]也采用该法提取玫瑰茄粗多糖，但多糖得率仅为5.3%。本实验采用响应面分析法优化玫瑰茄粗多糖的提取工艺条件，实验结果表明当液料比1∶26(g/mL)、提取时间3.1 h、提取温度90℃时，粗多糖的实际提取得率达到14.41%，该工艺条件提升了水提醇沉法提取玫瑰茄粗多糖的产量。响应面分析法作为试验设计与优化方法，它是将体系的响应值作为一个或多个因素的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，此方法不仅能全面地展示不同因素对响应值的影响，而且能分析各因素间的交互作用，从而有利于提取工艺的优化。本实验利用响应面分析法优化玫瑰茄干花萼中粗多糖的提取工艺，玫瑰茄粗多糖的实际得率与模型中预测得率误差小，说明该方法合理可行，优化的工艺条件可用于玫瑰茄粗多糖的提取。

自由基是指具有不成对电子的原子或基团，它们普遍存在于人体内。一定数量的自由基对人体是有益的，它们既可以参与免疫和信号传导过程，又可以用来杀灭体内的细菌和寄生虫。但是当人体内的自由基超过一定数量，便会失去控制，导致人体正常细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病，因此开发高效无毒的天然抗氧化剂作为自由基清除剂，清除体内多余自由基从而预防和治疗某些疾病，已成为当今科学研究的热点。本研究发现玫瑰茄粗多糖对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基都具有清除作用，清除率分别为45.89%、61.42%、81.42%，这说明本实验制备的玫瑰茄粗多糖具有抗氧化作用，可以作为潜在的自由基清除剂。然而本研究只在体外对3种自由基的清除效果进行了研究，在生物体内玫瑰茄粗多糖是否具有抗氧化作用还有待于进一步研究。

[1] Eslaminejad T, Zakaria M. Morphological characteristics and pathogenicity of fungi associated with Roselle (Hibiscussabdariffa) diseases in Penang, Malaysia.[J]. Microb. Pathog., 2011, 51(5):325-337.

[2] Ali B H, Wabel N A, Blunden G. Phytochemical, pharmacological and toxicological aspects ofHibiscussabdariffaL.: A review[J]. Phytother. Res., 2005, 19(5):369-375.

[3] Hopkins A L, Lamm M G, Funk J,etal..HibiscussabdariffaL. in the treatment of hypertension and hyperlipidemia: A comprehensive review of animal and human studies[J]. Fitoterapia, 2013, 85(1):84-94.

[4] Wahabi H A, Alansary L A, Al-Sabban A H,etal.. The effectiveness ofHibiscussabdariffain the treatment of hypertension: A systematic review [J]. Phytomed. Int. J. Phytother. Phytopharmacol., 2009, 17(2):83-86.

[5] Pérez-Ramírez I F, Castao-Tostado E, Ramírez-de León J A,etal.. Effect of stevia and citric acid on the stability of phenolic compounds and in vitro antioxidant and antidiabetic capacity of a roselle (HibiscussabdariffaL.) beverage[J]. Food Chem., 2015, 172:885-892.

[6] Zheng D, Zou Y, Cobbina S J,etal.. Purification, characterization, and immunoregulatory activity of a polysaccharide isolated fromHibiscussabdariffaL.[J]. J. Sci. Food Agric., 2017, 97(5): 1599-1606.

[7] Dacostarocha I, Bonnlaender B, Sievers H,etal..HibiscussabdariffaL. —— a phytochemical and pharmacological review[J]. Food Chem., 2014, 165(20):424-443.

[8] Liochev S I. Reactive oxygen species and the free radical theory of aging [J]. Free Rad. Biol. Med., 2013, 60(10):1-4.

[9] 邓春萌, 李 倩, 王 未,等. 响应面分析法优化富硒灰树花水溶性含硒蛋白的提取工艺[J]. 生物技术进展, 2017, 7(3):247-252.

[10] Zhang B, Mao G, Zheng D,etal.. Separation, identification, antioxidant, and anti-tumor activities ofHibiscussabdariffaL. extracts[J]. Separ. Sci. Technol., 2014, 49(9):1379-1388.

[11] 李 丽, 李 羚, 刘孟江,等. 响应面法优化云南永仁野生黄牛肝菌多糖微波辅助提取工艺及其抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技, 2017, 38(6):293-297.

[12] 徐运飞, 刘 琴, 宋 珅,等. 响应面法优化黄参多糖的提取工艺及其体外抗氧化活性[J]. 天然产物研究与开发, 2015(12):2116-2123.

[13] 张力妮, 张 静, 孙润广,等. 麦冬多糖的修饰及其抗氧化活性与空间结构的研究[J]. 食品与生物技术学报, 2014, 33(1):27-33.

[14] 宋思圆, 苏 平, 王丽娟,等. 响应面试验优化超声提取黄秋葵花果胶多糖工艺及其体外抗氧化活性[J]. 食品科学, 2017(2):283-289.

[15] Luo Q L, Tang Z H, Zhang X F,etal.. Chemical properties and antioxidant activity of a water-soluble polysaccharide fromDendrobiumofficinale[J]. Int. J. Biol. Macromol., 2016, 89:219-227.

[16] Xu Z, Wang H, Wang B,etal.. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from the leaves ofLiliumlancifoliumThunb[J]. Int. J. Biol. Macromol., 2016, 92:148-155.

[17] Ruizhan C, Chenguang J, Zhigang T,etal.. Optimization extraction, characterization and antioxidant activities of pectic polysaccharide from tangerine peels[J]. Carbohydr. Polym., 2016, 136(3):187-197.

[18] 张文莉. 玫瑰茄挥发油和多糖的成分分析与结构鉴定及其抗炎、免疫活性评价[D]. 广州：华南理工大学, 硕士学位论文,2016.

[19] Müller B M, Franz G. Chemical structure and biological activity of polysaccharides fromHibiscussabdariffa[J]. Planta Med., 1992, 58(1):60-67.