植物黄酮醇的检测方法研究进展

方 芳,王凤忠

(中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193)

黄酮醇作为一类重要的类黄酮化合物,在自然界中广泛分布[1]。因其具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗菌[4]、抗癌[5]等多种生理功能,对肥胖[6]、心脑血管疾病[7]及老年痴呆[8]等多种老年及慢性疾病具有重要的治疗和预防作用,而成为人类饮食中重要的功能活性因子。同时，因其对果蔬及食品的颜色[9]、口感及风味[10]的形成具有重要作用,而成为食品科学领域关注的重点。因此，对植物原料及食品中的黄酮醇进行定性定量分析对其相关产品的质量控制、安全性评价、药效研究及新产品开发等均具有重要意义[11]。

黄酮醇虽具有重要的生理功能,但其多以结合态形式存在于植物及果蔬中,且极易在5-、3′-及4′-位点通过与葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、果胶糖、木糖及葡萄糖醛酸等糖分子结合形成稳定的糖苷类化合物[12]。由于黄酮醇糖苷类化合物种类繁多、结构复杂、异构体多样、商业化标准品缺乏,且分离检测方法存在局限等问题导致其分离提取及检测分析十分困难[12-14]。因此了解植物黄酮醇分析检测方法的研究进展,对于现有黄酮醇类化合物检测方法的完善及新型检测方法的开发具有重要意义。本文对现有植物黄酮醇的检测方法进行了综述,以期为黄酮醇在食品、保健品及医药领域的深入研究及应用提供理论依据及技术参考。

1 不同方法在植物黄酮醇提取中的应用

1.1 紫外分光光度计法(UV spectrophotometer)

紫外分光光度计法是通过测定物质在特定波长下的吸光度或发光强度来对目标物质进行定性定量分析的方法[15]。是根据吸收光谱对目标化合物的成分、结构及与其它物质间的相互作用进行研究的有效手段[16]。与其它检测方法相比较,紫外分光光度计法具有操作简单、仪器及检测成本低、检测时间短等特点[15,17],目前在医药领域黄酮类物质的检测中应用较多。赵猛等通过与化学计量学手段结合,成功构建了一种可同时对紫花地丁中槲皮素和七叶内酯含量进行测定的紫外分光光度检测法,该方法检测快速、操作简单、重现性好,可作为中草药中槲皮素含量测定的备选方法[18]。Chaudhari等采用紫外分光光度计建立了一种可同时对囊泡制剂中的芦丁和槲皮素进行检测的方法,该方法简单、快速、灵敏度高、准确性好,在257 nm和372 nm的检测波长下可分别对芦丁和槲皮素进行定量研究[19]。次年,Chaudhari等又利用紫外分光光度计建立了一种可同时对囊泡制剂中的槲皮素和盐酸曲马多进行检测的方法,该方法除可简单快速对样品进行测定外,还具有灵敏度高、特异性强的特点,在372 nm处可对槲皮素有效检测[20]。陈志刚等建立了一种可对原料药中槲皮素含量进行快速测定的紫外分光光度检测方法,该方法可在374 nm处对槲皮素含量进行有效测定,精密度高,线性良好,回收率可达100.88%,满足方法学要求,是测定原料药中槲皮素含量的可行方法[17]。由此可见,紫外分光光度计法作为植物类黄酮化合物检测的传统方法,具有操作简单、检测成本低、检测时间短等优点,但由于检测过程中目标化合物易受基质溶液、检测体系中其它组分及吸收池的洁净程度等因素的干扰[18],导致其在植物黄酮醇类化合物的检测应用中受到限制,目前有关天然黄酮醇类化合物的检测多应用于传统中草药或药物制剂的检测中,且可检目标化合物的种类有限,而针对食品等复杂基质中的黄酮醇类化合物的检测研究较少。在后续研究中,如何有效克服复杂基质及其它组分的干扰将成为未来紫外分光光度计法需要重点解决的问题。

1.2 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)

高效液相色谱法是利用处于高压环境中的待测化合物在固定相和流动相间具有连续交换的特性,借助待测化合物在两相间的分配系数、亲和力及吸附能力的差异对其进行分离的方法。其是在传统液相色谱法的基础上发展起来的新型检测方法[21],同时也是对植物类黄酮化合物进行检测的最精选的方法。与紫外分光光度计法相比,其具有检测限低、灵敏度高、分析效率高、分析范围广等优点[21-22]。高效液相色谱作为一种高效的分离体系,要实现对目标化合物的定性定量分析,最终需要与多种检测体系相结合,目前应用较多的包括紫外检测、荧光检测或二极管阵列检测等检测系统[12,23],而HPLC-UV和HPLC-DAD检测法等也已成为从植物及食品原料中对黄酮醇等类黄酮化合物进行定性定量分析最为有效的方法之一[24-25]。Niu等通过反相高效液相色谱-二极管阵列检测(RP-HPLC-DAD)建立了一种可对传统中草药返魂草(SeneciocannabifoliusLess)中9种黄酮醇类化合物同时进行分析检测的方法。该方法采用C18柱为分离柱,乙腈水溶液为流动相,经梯度洗脱可对样品中的黄酮醇类化合物进行有效分离及识别,9种黄酮醇的回收率均介于90.6%～102.5%之间,最低检测限介于0.028～0.085 μg/mL之间。该方法灵敏度高、检测效果良好,为中草药黄酮醇类化合物的检测提供了一种行之有效的方法[25]。买买提·吐尔逊等通过高效液相色谱-二极管阵列检测(HPLC-PAD)构建了一种可对新疆不同品种巴旦杏中的槲皮素及山奈酚等黄酮醇类化合物进行定量研究的方法,该方法以甲醇-磷酸溶液(55∶45,V/V)为流动相,在360 nm检测波长下可对样品中的槲皮素及山奈酚进行良好分离,回收率高、线性范围良好,可作为对巴旦杏进行质量控制和评价的理想检测方法[26]。Benmeziane等采用HPLC-DAD法对3个不同鲜食红葡萄品种的果皮黄酮醇进行测定,共检测到4种黄酮醇糖苷类化合物,其中多以槲皮素糖苷类化合物为主[27]。Ma等构建了一种可对银杏叶中黄酮醇类化合物进行快速检测的HPLC检测方法。该方法可在13 min内对银杏叶提取物中的黄酮醇苷元(槲皮素、山奈酚和异鼠李素)及糖苷类化合物(芦丁)进行同时检测。通过对13种银杏叶样品,15种标准品提取物和10种银杏叶产品进行分析,发现黄酮醇类化合物的种类和含量可作为判断银杏叶提取物及其相关产品是否掺假的重要依据,从而为银杏叶产品的鉴伪提供了切实可行的方法[28]。由此可见,高效液相色谱法作为在传统液相色谱法的基础上发展起来的新型检测方法,目前在多种植物源食品及中草药黄酮醇类化合物的分析检测中已得到应用,其所检出的化合物包括黄酮醇苷元及黄酮醇糖苷等多种。与紫外分光光度计法相比,具有检测范围广、检测限低、灵敏度高等优势,但因其检测设备成本较高、单个样品检测时间较长、操作步骤复杂、对样品前处理要求高、试剂消耗量大等缺点[22,29]导致其在植物黄酮醇类物质检测中仍受到一定限制,而在复杂体系中无法对低含量化合物进行有效分离和定量等问题,也成为制约其在植物黄酮醇检测中更加广泛应用的重要原因。因此在现有分离检测体系上开发更加高效和灵敏的分离和检测技术及设备成为高效液相色谱法发展的必然趋势。

1.3 液相色谱-质谱检测法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)

液相色谱-紫外检测法或液相色谱-二极管阵列检测法等因其具有成本相对较低、操作相对简单等特点而在植物及食品类黄酮化合物的检测中得到广泛应用[13,30]。但由于自然界中黄酮醇糖苷类化合物种类繁多、结构复杂,单纯采用高效液相色谱结合普通检测器很难实现对于某些含量较低的黄酮醇糖苷类化合物的有效分离和准确定量[13]。液相色谱-质谱检测法因其在获得紫外光谱信息的同时,还可对目标化合物的相对分子质量和碎片离子进行检测,对物质结构进行综合解析,同时具有灵敏度高、抗干扰能力强等特点,目前已成为对自然界中黄酮醇类化合物进行定性定量检测最为常用的方法之一[31-32]。Yaque等通过LC-UV-ESI-MS/MS对银杏(GinkgobilobaL.)花中的黄酮醇类化合物进行识别,发现槲皮素糖苷类化合物是银杏花的重要组分[33]。Wu等建立了可同时对绿茶、红茶、乌龙茶中的黄酮醇等24种多酚类化合物进行检测的HPLC-UV/ESI-MS检测方法,该方法通过色谱保留时间和质谱信息同时对目标化合物进行识别,并对不同品种中的酚类构成进行区分,发现在目标化合物标准品缺失的情况下,质谱信息可作为识别目标化合物的有力补充,该方法可作为检测绿茶、红茶及乌龙茶中黄酮醇等酚类化合物的行之有效的方法[34]。Wu等通过高效液相色谱串联飞行时间质谱(high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometer,HPLC-TOF-MS)对4个不同野茶树(Camelliasinensis)品种中的15种黄酮醇糖苷类化合物进行识别,并通过超高效液相色谱串联三重四极杆质谱(high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer,HPLC-QQQ-MS/MS)的多反应检测模式(multiple reaction monitoring,MRM)对黄酮醇糖苷类化合物进行定量,检测限和定量限的结果显示该方法比HPLC检测法灵敏性高、数据重现性好。黄酮醇在茶树中多以单糖苷、双糖苷及三糖苷等形式存在,且主要分布在嫩叶中,受试各茶树品种中myricetin-3-O-galactoside的含量最高[13]。Souza等采用异亚丙基对黄酮醇葡糖苷和半乳糖苷异构体进行修饰,通过液相色谱串联多级质谱(LC-MSn)手段对黄酮醇葡糖苷异构体和半乳糖苷异构体进行识别,发现该方法可有效解决黄酮醇糖苷异构体难以识别的问题,同时该方法为复杂基质中多糖的识别提供了可能[14]。由此可见,高效液相色谱-质谱检测法因其可对物质的相对分子质量和碎片离子进行有效获取,对物质结构进行综合解析等特点而成为继传统高效液相色谱检测法后发展起来的新兴的检测方法。在检测某些复杂化合物及低含量化合物时可作为传统高效液相色谱检测法的有力补充。目前在植物黄酮醇及其糖苷类化合物的检测中得到一定应用,在黄酮醇糖苷类化合物的识别上尤其发挥重要作用,通过对黄酮醇糖苷异构体进行适当修饰,甚至可用于黄酮醇糖苷异构体的识别领域。但该方法的缺点是检测成本高,仪器普及性低,无法从复杂混合物中对目标化合物的异构体进行有效识别,因此目前其应用还十分有限[14,32]。而核磁共振虽可对化合物的分子结构进行有效识别,但对样品的纯度和含量要求较高,而样品纯化过程通常费时费力,因此自然界中黄酮醇类化合物的有效识别仍存在较大技术难题[14],高效液相色谱-质谱检测法仍有很大改进和发展空间。

1.4 超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)

超高效液相色谱法是在HPLC法基础上发展起来的一种全新的检测方法。与HPLC法相比,其具有快速、高效、分辨率高、灵敏度好等特点[12]。近年来其在检测难度较高的黄酮醇苷元及糖苷类化合物的测定中也越发受到关注。Shim等构建了一种可同时对食品中杨梅酮、槲皮素、山奈酚及异鼠李素等黄酮醇苷元进行快速检测的超高效液相色谱-光电二极管阵列检测法(UPLC-PDA)。该方法采用反相C18柱为分离柱,对杨梅酮、槲皮素、山奈酚及异鼠李素等黄酮醇类化合物进行分离,各物质最低检测限分别可达0.15、0.09、0.16和0.08 mg/kg,最低定量限分别为0.47、0.28、0.49和0.25 mg/kg。在保证各峰有效分离的情况下检测时间仅需13 min,大大提高了食品中黄酮醇苷元类化合物的检测速度、灵敏度及分辨率[12]。张维冰等建立了一种通过超高效液相色谱-光电二极管阵列检测-串联四极杆质谱(UPLC-PAD-MS/MS)对红洋葱中黄酮醇类化合物进行测定的方法,该方法不仅可对红洋葱中13种黄酮醇及其糖苷类化合物同时进行检测,而且可对红洋葱不同部位的黄酮醇类化合物的分布和含量进行区分,为洋葱中黄酮醇类化合物的测定提供了一种简单快速、准确性好的检测方法[35]。Kim和Shim建立了一种可对荞麦、红茶、野生欧芹中12种黄酮醇糖苷类化合物同时进行测定的检测方法。该方法采用UPLC对黄酮醇糖苷进行分离,PDA对目标物质进行检测,在350 nm检测波长下,12种黄酮醇糖苷的回收率均较高,介于85.44%～108.79%之间,最低检测限和最低定量限分别为0.32 mg/kg及0.97 mg/kg。方法准确性好、灵敏度高,为植物黄酮醇糖苷类化合物的检测提供了新的选择[32]。王智聪等通过超高效液相色谱-二极管阵列检测-串联质谱(UPLC-PD-MS/MS)联用技术对茶叶中黄酮醇糖苷类化合物进行测定,在绿茶和红茶中共识别到15种黄酮醇糖苷类化合物,其中包括6种槲皮素糖苷、3种杨梅酮糖苷及6种山奈酚糖苷类化合物。经串联四极杆质谱对样品中黄酮醇糖苷类化合物进行定量检测发现,黄酮醇糖苷类化合物在绿茶和红茶中的含量和分布存在显著差异(p<0.05),其中绿茶中的黄酮醇糖苷类化合物总量约为红茶的1.7倍。经验证该方法简单、快速、准确,可作为茶叶中黄酮醇糖苷类化合物分析检测的可行方法[31]。Jiang等首次采用UPLC法对绿茶、乌龙茶及红茶中的黄酮醇糖苷类化合物进行检测,通过电喷雾串联质谱共识别到18种黄酮醇糖苷类化合物,所检测到的黄酮醇糖苷类化合物的总量为2.32～5.67 g/kg。在对不同茶种中的黄酮醇糖苷类化合物进行对比分析时发现,黄酮醇糖苷在绿茶、乌龙茶及红茶中的总量无显著差别,但不同茶种中的单体黄酮醇糖苷种类和含量不同,其中绿茶中以山奈酚糖苷为主,乌龙茶中以槲皮素和杨梅酮糖苷为主,而红茶中则以槲皮素糖苷类化合物为主,证明该方法可作为区分不同茶种的重要依据[36]。由此可见,超高效液相色谱法因其采用更高的压力和更短的色谱柱,使得其色谱峰的分散度变小,检测速度、分辨率及敏感性显著提高,较之传统HPLC检测法具有操作简单、准确度高、检测时间短、检测效率和灵敏度高、对目标化合物的分离能力强等优点[12,31]。目前其在包括茶叶、洋葱、银杏等多种食品和植物的黄酮醇苷元及糖苷类化合物的检测和定性定量研究中已得到一定应用,在食品掺假和植物品种或组织部位的识别和区分上可作为重要参考。

1.5 毛细管电泳法(capillary electrophoresis,CE)

毛细管电泳法是以毛细管为分离平台,高压直流电场为驱动力,根据目标化合物在特定环境中的淌度及分配行为不同对其进行分离的一种液相分离技术。其是现代微柱分离技术与传统电泳技术完美结合的产物[37]。与传统色谱检测方法相比,毛细管电泳法具有柱效高、分辨率好、自动化程度高、适用范围广、分析时间短、前处理简单、对试剂及样品的消耗量小、经济环保等优点[23,29,38]。作为HPLC法的重要替代方法目前已在植物及食品黄酮醇类化合物的分析中得到广泛关注[23,29]。郭芳芳等通过高效毛细管电泳法对不同产区苦荞中的黄酮醇类化合物进行检测,发现在优化的电泳条件下,芦丁、槲皮素、山奈酚等黄酮醇类化合物可以得到良好分离,在7 min的检测时间内,各物质的最低检测限分别可达1.80×10-5、1.24×10-5和2.51×10-5mg/mL,平均回收率介于95.5%～104.7%之间,证明该方法可作为检测苦荞中黄酮醇类化合物准确可靠的方法[39]。Gatea等建立了一种可在27 min内对蜂胶及植物提取物中20种多酚类化合物进行测定的毛细管电泳检测方法,该方法可对芦丁、槲皮素、山奈酚及高良姜素等黄酮醇类化合物进行良好分离,在优化的电泳条件下各化合物最低检测限和定量限分别介于0.02～1.75 μg/mL和0.07～5.77 μg/mL之间[23]。Wang等采用毛细管电泳结合安培检测法建立了一种可对传统中草药中8种类黄酮化合物进行分离检测的方法,在分离电压2000 V,缓冲液浓度18 mmol/L,溶液pH为10.2的条件下,可对芦丁、槲皮素、槲皮甙、山奈酚及芹菜素等黄酮醇类化合物在33 min内实现良好分离,且检测限均较低。采用该方法可对包括沙棘、贯叶连翘和侧柏叶等传统中草药中的芦丁、槲皮素、槲皮甙和山奈酚等化合物成功检出,且各化合物的回收率均较高,分别介于84.7%～113%之间,证明该方法可用于传统中草药中黄酮醇类化合物的定性定量研究[40]。Memon等采用毛细管电泳结合光电二极管阵列检测器(CE-PAD)建立了一种可对水果中类黄酮化合物进行快速分离的检测方法。在缓冲液浓度为10 mmol/L,pH为8.5,检测电压为25 kV时,可对芦丁及槲皮素等黄酮醇类化合物进行有效分离,方法稳定性高,重现性好,可作为水果及果汁中黄酮醇类化合物检测的有效方法[38]。由此可见,毛细管电泳法目前已在多种植物及食品的黄酮醇类化合物检测中得到探索性应用,所检测的黄酮醇类化合物的种类日益增多。作为HPLC法的重要替代方法其在植物及食品中包括黄酮醇类化合物在内的多种生物活性物质的检测中具有很好的应用前景[23,29]。但毛细管电泳法因其分离机理不同,具有包括毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)、胶束电动毛细管色谱(micellar electrophoresis capillary chromatography,MECC)、毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)、毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing,CIEF)、毛细管等速电泳(capillary isoelectric-phoresis,CITP)等多种分离模式和激光诱导荧光检测(LIF)、紫外检测(UV)、质谱检测(MS)及安培检测(AD)等多种检测方法[37,40],目前在植物黄酮醇类化合物检测上的应用模式还十分有限,在后续研究中还有待进一步拓宽。

1.6 电化学检测法(electrochemical detection,ED)

虽然目前植物黄酮醇类化合物的检测多以紫外分光光度计法、色谱法等进行,但分光光度计法的选择性差,色谱法分析时间长、试剂消耗量大、检测成本高[29],且对前处理的要求高,程序复杂、设备昂贵,从而给黄酮醇类化合物的检测分析带来诸多不便,因此近年来一些新兴的电化学实验手段也在逐渐涌现[41-42]。电化学检测法是以研究对象的电响应为基础发展起来的分析方法,其通过对电池参数变化的测定可获得目标物质的含量及电化学性质[11]。由于黄酮醇类化合物具有明显的电化学活性,因此电化学检测法是较适合植物黄酮醇检测的方法[43]。Wang等采用多壁碳结合1-十二烷基-3-甲基咪唑复合电极对芦丁进行测定,发现该电极对芦丁的氧化还原反应具有电催化作用,通过电荷转移系数和标准速率常数可得芦丁电化学参数,其最低检测限可达0.01 μmol/L,由于该电极较之其它离子性液体电极具有更好的电化学性能,灵敏度高、稳定性好,可有效排除杂质干扰,为芦丁的检测提供了切实可行的方法[44]。Sun等采用基于结合石墨烯聚吡咯膜的分子印记聚合物对槲皮素进行电化学测定,采用差动脉冲伏安法对槲皮素的电化学行为进行分析,发现该方法具有良好的稳定性和重现性,可有效排除杂质化合物的干扰,槲皮素的检测限可达4.8×10-8mol/L,证明该方法可用于复杂基质中槲皮素的检测[43]。Arvand和Anvari采用石墨烯修饰的玻碳电极为反应电极,通过差动脉冲伏安法对苹果和洋葱中的槲皮素的电化学行为进行分析并对其进行定量测定,确定槲皮素的检测限为3.6 nmol/L,证明该方法可用于食品中槲皮素的检测[42]。王微采用分子印迹技术,分别以槲皮素、桑色素等黄酮醇类化合物为印记分子,利用电化学聚合的方法开发了一种黄酮醇分子印迹邻苯二胺薄膜电化学传感器,并对槲皮素及桑色素等黄酮醇类化合物的最佳测定条件进行优化,发现该方法灵敏度高、选择性好,对银杏叶类药物中槲皮素含量测定的回收率可达99.2%～102%之间,可作为植物黄酮醇测定的可行方法[45]。由此可见,电化学检测法作为一种快速、高效、灵敏度高、检测限低的检测方法[11],目前其在植物黄酮醇的检测中已得到一定应用。有关电极种类、材料、测定方法及目标化合物的种类等方面的研究正日益深入。电化学测定法作为一种以电化学反应原理及目标物质的电化学性质为基础的检测方法,其较适用于具有电化学特性的黄酮醇类物质的检测[11],在未来研究中还有很大的发展空间。

2 问题与展望

黄酮醇作为与人体健康密切相关的生物活性因子,其种类及含量的多少是衡量其相关产品质量优劣的重要依据,因此开发合适的定性定量分析检测方法对其相关产品的质量控制、安全性评价、药效分析及新产品开发等均具有重要意义。但黄酮醇类化合物种类繁多、结构复杂、异构体多样、商业化标准品缺乏等问题给其分析检测工作带来极大障碍及困难,因此如何从植物原料中对黄酮醇类化合物进行有效检测便显得尤为重要。近年来紫外分光光度计法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱检测法、超高效液相色谱法、毛细管电泳法及电化学检测法等多种分析检测方法已在植物黄酮醇的测定过程中得到应用,但相关研究工作范围较窄、所涉及的植物或食品种类及目标化合物种类均存在较大局限,且现有检测方法的构建缺乏系统性和延续性。

针对上述问题,未来在植物黄酮醇检测方法的研究中,应注意将目标化合物自身的性质和现有检测方法的特点有机结合,充分发挥不同检测方法的优势,弥补其不足,加强分析检测工作的系统性和连贯性。在应用紫外分光光度计法时应注意开发可有效缩减或排除基质及检测体系中其它组份干扰的方法。在应用色谱检测法时应注意开发可有效缩短检测时间、减少试剂用量、降低检测成本的方法。在应用毛细管电泳检测法时注意加强对新型检测模式的探索。在电化学检测法的应用过程中注意加强新型检测电极及材料的开发等。

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