IVF中卵母细胞线粒体的治疗进展

张建霞，张宁，李子涵

(山东中医药大学，济南　250000)

近年来随着二胎政策的全面放开，高龄女性生育二胎的要求增加，其面临的不孕和高流产风险成为国内外学者探讨的热点。卵母细胞的质量是直接影响正常妊娠和造成反复流产的主要因素。人成熟的卵母细胞是人体含有线粒体最多的细胞，内含有超过10万个线粒体。线粒体在卵母细胞中，不仅是“能量工厂”，也是卵母细胞内除细胞核以外唯一携带DNA的细胞器，在促进卵母细胞的成熟、精卵结合和胚胎发育过程中的转录与翻译提供能量等方面有重要作用。此外，有研究发现，卵母细胞线粒体与卵母细胞激活、钙振荡、凋亡程序启动等生命过程密切相关[1]。且在哺乳动物的胚胎中，因精子的线粒体在受精的过程中被损坏了，胚胎中的线粒体全部依赖于卵母细胞[2]。针对ART中存在胚胎质量优良却移植失败的现象和线粒体遗传疾病，现对卵母细胞线粒体病变在生殖领域的治疗进行综述。

一、卵母细胞线粒体简介

1.结构和空间分布：线粒体是双层膜的细胞器，电镜下由内膜和外膜、基质和嵴构成。不同细胞内的线粒体有不同的结构，卵母细胞线粒体多呈圆形。在卵母细胞成熟过程中，其空间分布可作为评估卵母细胞质量的一项指标。在生发泡期(germinal vesicle，GV期)，线粒体处于幼稚状态，多呈圆形、少嵴，分布在细胞质中；在生发泡破裂期(germinal vesicle breakdown，GVBD)，线粒体已成熟，聚集于细胞核周围，呈长梭形，多嵴；第二次减数分裂(Meiosis，MⅡ)，线粒体沿纺锤体分布，以辅助纺锤体的形成和染色体的分离。

2.线粒体DNA(mtDNA)：人成熟卵母细胞中每个线粒体含有1～2个mtDNA，而mtDNA拷贝数范围在3万～100万[3]，在卵母细胞中mtDNA拷贝数与受精、胚胎发育潜能成正相关[4]。与细胞核DNA相比，mtDNA 因缺乏组蛋白的保护和必要的DNA损伤修复系统[5]，且处于高自由基的环境中，更容易突变或受损，从而影响受精率和胚胎发育潜能。因卵母细胞成熟后(MⅡ期)mtDNA停止复制，直至囊胚期才恢复，卵胞浆中的线粒体对胚胎的发育显得尤为重要。

3.代谢途径：哺乳动物的卵母细胞线粒体主要是通过糖酵解途径和磷酸戊糖途径产生ATP[6]。卵母细胞中，线粒体在限制最低水平活性氧(reactive oxygen species，ROS)的条件下，迅速有效地为细胞“定点”提供能量，低剂量的ROS能调控卵母细胞成熟，若线粒体能量产生过程中释放过多ROS，卵母细胞处于氧化应激状态，会造成mtDNA的氧化损伤、突变和缺失，从而影响卵母细胞成熟与受精。

二、影响卵母细胞线粒体的因素

1.高龄：年龄是导致卵母细胞质量下降的直接因素[7]，主要表现在两点：卵母细胞的数量随着年龄的增长逐渐减少，mtDNA拷贝数下降、突变和缺失增加；卵母细胞的质量逐渐降低，即卵母细胞老化，分为排卵前老化和排卵后老化。排卵前卵母细胞依靠卵泡壁颗粒细胞和卵丘细胞提供能量，而排卵后卵母细胞自身线粒体开始激活，线粒体嵴增多，通常认为年龄与排卵前老化相关。

2.糖尿病、肥胖：肥胖和糖尿病患者体内卵母细胞处于氧化应激状态，李俐琳等[8]用动物实验研究了肥胖对小鼠卵母细胞体内老化的机制，证实肥胖会促进卵母细胞排卵后老化，其中最主要的原因还是氧自由基对卵母细胞的损伤。肥胖小鼠卵母细胞内线粒体相关内质网膜(MAM)相关蛋白IP3R1和PACS-2的增加也会导致线粒体异常[9]。这表明MAM含量的增多可以成为卵母细胞线粒体异常的一个指标，为肥胖导致的卵母细胞的线粒体损伤提供新的治疗靶点。

三、卵母细胞线粒体缺陷引起的疾病

1.反复种植失败和流产：高龄妇女的抗氧化能力下降，自由基减少，ROS堆积，同时伴随供能的ATP减少，导致卵母细胞减数分裂过程中染色体分离障碍，形成非整倍体胚胎，而非整倍体胚胎是反复种植失败和流产的主要因素。

2.卵巢储备功能减退(decreased ovarian reserve，DOR)：Slotkin等[10]认为ATP水平低下可激活卵的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号途径，导致原始卵泡的异常激活、丢失增多，卵泡过早衰竭逐渐发展为DOR。

3.线粒体遗传性疾病:线粒体遗传性疾病是母系家族性疾病，是由于卵母细胞中的mtDNA突变引起[11]，其临床表现多样，包括：线粒体脑肌病、线粒体遗传性糖尿病、胃肠综合征、肌张力障碍等[12]。

四、卵母细胞线粒体病变在生殖领域的治疗现状

1.卵胞质移植(ooplasmic transfer，OT)：将供体卵母细胞的部分细胞质经显微操作技术移植到受体卵母细胞内，再对重构卵进行胞质内单精子注射，称为OT，尤其是年轻供者卵母细胞胞浆中的线粒体对高龄女性受者卵母细胞可能发挥补充作用。OT技术早已提出并被首次使用在大龄不孕不育患者中，且获得了成功[13]。但有研究显示外源性线粒体虽然对受体卵胞质有一定活性和功能，但有功能的卵胞质被引入的同时也会造成受精卵的异质性[14]，造成极大潜在安全隐患。最近，一项随访研究报道，年龄在13至18岁的OT出生儿童身体大致健康，基本认知能力正常，但有的小孩会伴有轻微的皮肤问题、轻微视觉障碍、轻度哮喘和慢性偏头痛[15]。该项研究显示大量捐赠者卵胞质移植入受体卵母细胞，可能不是最可行的方法。

2.线粒体替代疗法[16](mitochondrial replacement therapy，MRT)：用外源性健康的线粒体补充或替代发育阻滞的卵母细胞或受精卵中的异常线粒体。(1)原核移植(pronuclear transfer，PNT)：是先使携带异常线粒体的卵母细胞受精，然后将受精卵的细胞核移植到捐赠者去核的卵细胞内，再植入携带异常线粒体的母体内。2010年首次报道了PNT，此移植后的胚胎中3%～8%可发育到卵裂期，且遗留少量受体卵母细胞的mtDNA，其安全性和有效性还无法得到保证[17]。2016年Hyslop等[18]在该PNT的基础上进行了改进，在卵母细胞减数分裂完成后立刻(ICSI后8 h内，早期PNT)进行PNT，而不是在受精卵第一次有丝分裂前(ICSI后16 h，晚期PNT)进行PNT。改进后，遗留的mtDNA比绝大多数卵裂期的PNT减少至2%，此方法降低了线粒体遗传病的发生。(2)纺锤体移植(spindle transfer，ST)：是将母亲和捐献者卵母细胞中MⅡ期细胞核先移走，再将母亲卵细胞的核注入捐献者卵细胞中，用获得的新卵母细胞与精子受精。纽约新希望生殖中心Zhang等[19]在2016年9月首次利用ST将捐献者的卵母细胞线粒体取代携带Leigh syndrome变异基因的卵母细胞线粒体，帮助一对夫妻顺利生产出健康男婴。科学家们对该男婴的线粒体进行了检测，结果显示含有变异基因的线粒体不到1%，该比例不会造成任何健康问题。他们还会继续对该男婴跟踪检测，以确保保持该比例。该技术减少了mtDNA的突变量，但因该方法首次使用且考虑mtDNA的异质性漂移，持续追踪该男孩的健康状况很有意义。

3.自体生殖细胞线粒体移植(autologous germiline mitochondrial energy transfer，AUGMENT)：自体生殖细胞包括卵母干细胞(oogonial stem cells，OSCs)和成熟卵母细胞。据报道[20]人类的OSCs需要通过皮质活检从卵巢中分离出来，再通过差异离心的方法离心出卵母干细胞的线粒体，再结合ICSI技术把线粒体注入卵母细胞来改善卵母细胞的质量，可解决卵胞质移植出现的细胞异质性问题，但是否通过了遗传瓶颈且适合下一代目前未得到证明[21]。通过自体卵母细胞线粒体移植使有缺陷卵母细胞恢复高质量的线粒体，已经应用于少数不孕不育夫妇[22]。相比于OSCs，利用IVF、未成熟卵体外培养成熟(IVM)和原始卵泡体外激活术(IVA)剩余的成熟卵母细胞更简单易获取，且通过了线粒体基因瓶颈[23]，有望移植后改善卵母细胞线粒体的质量。

4.自体间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)线粒体卵母细胞移植：MSC是来源于中胚层的一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞[24]，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中。它不仅能够向多种组织和细胞分化，而且易于分离、培养、扩增，易于外源基因的导入和表达，在体外长期培养时能始终保持多向分化的潜能。与成体细胞线粒体相比，干细胞线粒体具有球形、嵴数目少、ATP通过糖酵解转化等与卵母细胞线粒体相似的特征[25]。据此姚元庆[26]在2017年“上海市中西医结合学会生殖医学专业委员会”上分享了新的研究思路和临床策略，将自体脂肪组织MSC线粒体移植到高龄不孕女性的卵母细胞，来纠正线粒体功能不全，改善ART的临床结局，已在小鼠身上证实了线粒体注射后，老龄MⅡ卵细胞的mtDNA拷贝数显著升高。它的优势在于：采取自体线粒体移植不存在线粒体异质性；其次，避免第三方基因组所带来的伦理问题；第三，不需要第三方供卵，提高临床应用的可行性。目前该方法已应用在动物上，证明自体间充质干细胞线粒体移植能够改善高龄卵母细胞质量，相关在人体上的研究正在后期进行中。

5.口服药物：(1)西药：饮食中补充线粒体营养物能有效改善成熟卵母细胞和胚胎线粒体的能量[27]，α-亚麻酸通过增加卵母细胞mtDNA拷贝数和降低氧化应激反应提高卵母细胞的发育潜能。辅酶Q10可保护线粒体不受化学损伤，增加卵母细胞线粒体ATP合成，减少ROS水平，减少非整倍体卵母细胞的产生。有实验数据表明52周鼠龄的ICR鼠，其补充辅酶Q10能明显增加卵母细胞的数量和线粒体活性，是提高质量受损的卵母细胞线粒体功能的一个途径[27]。(2)中药：林飞等[28]提出线粒体在某种意义上反应了中医“气”的作用，即气的物质属性可能是线粒体，有共同的物质起源、都是构成生命体的微小物质、都负载着生命现象、功能相似等。邱林等[29]总结出中医药通过对线粒体的保护来影响能量代谢。郭颖等[30]实验得出：二至天癸颗粒可能通过改善小鼠胚胎线粒体膜电位来提高受精率、卵裂率，从而改善卵母细胞的质量和早期胚胎的发育潜能。

五、总结

卵母细胞线粒体作为卵母细胞的能量工厂，其结构和功能异常是妊娠失败的重要因素。随着科学家对卵母细胞线粒体病变的研究深入，其治疗方案逐步接近自然生理状态，包括中医药对人的整体改善作用，以期待中西医结合来提高卵母细胞线粒体的质量，对辅助生育技术有新的突破。

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