小分子泛素相关修饰物SUMO融合外源蛋白表达的研究进展

荣雅昕，王英超，张耀方，卢顺娇，周倩，陈慧慧

（天津农学院基础科学学院，天津 300384）

SUMO是存在于真核生物中起相关修饰作用的一类蛋白质，具有调节蛋白转运、相互作用，维持基因完整性等多种功能[1-3]。SUMO家族有4个成员，其蛋白长度略有差别：SUMO1由101个氨基酸组成，SUMO2有103个氨基酸，而SUMO3和SUMO4只有95个氨基酸。目前，对SUMO家族成员的研究已经成为今后一段时期的研究热点。

1 SUMO融合表达系统的优点[4]

与传统的蛋白融合标签，如多聚组氨酸标记、融合八个氨基酸的亲水性多肽、麦芽糖结合蛋白等相比，SUMO融合表达系统除了具备促进可溶性的特性外，还具有以下优点。

1.1 抗蛋白酶降解

在细胞内，蛋白酶解受到严密调控，重组的蛋白质极易被降解。以SUMO作为融合标签进行表达时，可以降低细胞内蛋白酶的敏感性，提高融合蛋白的稳定性。

1.2 提高蛋白的折叠率

大肠杆菌大量表达含有二硫键的蛋白时，常形成错误的非活性包涵体结构。以SUMO作为融合标签在大肠杆菌中进行表达，可以增强融合蛋白的溶解性，提高蛋白质的折叠率。

1.3 提高重组蛋白表达量

蛋白质的表达量与多种因素相关，而重组蛋白的表达量与转录的延伸、翻译的加强紧密相关。以SUMO作为融合标签进行表达，能够在一定程度上抵抗蛋白酶的降解，促进蛋白质的折叠，从而间接地提高了蛋白质的表达量。王中原[5]研究发现，人SUMO01、SUMO02融合标签改善了基质金属蛋白酶13的可溶性，增强了绿色荧光蛋白的表达水平和可溶性。武阳[6]发现MT在SUMO融合表达系统中表达量更高。

1.4 无误地切除融合标签且快速高效，酶切条件宽松

SUMO作为表达标签，酶切后得到的蛋白质保持了天然结构，便于日后的功能分析。酶切条件宽松（温度4～37 ℃，pH5.5～10.5、2mol/L尿素），切除快速高效，准确无误。

2 原核生物中的SUMO融合表达

SUMO融合表达系统因种种优势，目前已经被广泛应用于以大肠杆菌为代表的原核表达系统中。Li等在中国家蚕中分离出抗菌肽CM4，通过rPCR克隆到pET32a载体上，构建了融合表达质粒。使用SUMO蛋白酶进行切割，效率达到90%以上[7]。某些抗菌肽，如IDR1、MX226、LL37、CRAMP、HHC-10和E5等对大肠杆菌具有毒性，不适宜与大肠杆菌融合进行融合表达。SUMO融合标签则完美地解决了这一问题，该融合标签可以有效屏蔽抗菌肽对宿主菌的毒性。SUMO也应用于多聚体表达，JF Li等[8]为了提高CM4在大肠杆菌中的表达水平，对CM4基因串联重复序列分别克隆到表达载体pSUMO上构建出新的表达载体pSUMO-2CM4。融合蛋白SUMO-2CM4经镍柱螯合层析纯化，用盐酸羟胺裂解释放重组CM4，102L培养物中获得4802mg重组CM4，纯度大于96%。此外，SUMO也可以与硫氧还蛋白作为融合标签共同使用。Li[9]在研究中发现，在SUMO/肽的连接点，LL-37抗菌肽被SUMO蛋白酶裂解产生N-末端。利用凝胶色谱分离释放出的肽段。平均每1 L细菌培养能够得到2.4mg抗菌肽。质谱分析证明，重组肽的分子量在理论上是预期的。所产生的肽对大肠杆菌K-12具有抗菌活性。SUMO融合表达在枯草芽孢杆菌表达系统中同样得到很好的应用。Chen等[10]融合了抗菌肽基因与小泛素样修饰（SUMO）基因和基因信号肽，在枯草芽孢杆菌表达构建了一种基于操纵子基因修饰的枯草芽孢杆菌细胞系统。包括异丙基-D-半乳糖苷（IPTG）诱导的启动子Spac、amyQ信号肽、SUMO蛋白酶基因。从1L培养的上清液中可以分离纯化出30.6mg的重组蛋白，纯化的抗菌肽AD对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌性较强。肖亮[11]以4种人源SUMO蛋白作为融合标签，构建4种融合表达载体—pSl、pS2、pS3、pS4。比较4种SUMO-tag促表达和促溶效果的高低，研究发现，以SUMO1作为融合标签时，对于P53和GFP两种重组蛋白的促表达和促溶效果是最好的。有切割的SENPICP53和GFP两种重组蛋白的促表达和促具有较好的可溶性。张杰[12]建立了一种新的在大肠杆菌中促蛋白可溶性高效表达系统。ELP-SUMO融合蛋白大多数以可溶形式表达，质谱结果表明得到的重组蛋白分子量与天然蛋白一样，目的蛋白具有活力。

3 真核生物中的SUMO融合表达

利用大肠杆菌作为宿主菌进行表达时，常出现蛋白质错误折叠、蛋白质降解和溶解度低的情况。真核生物在蛋白表达时，会利用自身的蛋白酶进行校正，减少了错误的发生。真核生物细胞内存在内源SUMO蛋白酶，会切除SUMO融合蛋白，限制了SUMO作为融合标签的应用[13-14]。为了解决此类问题，Butt等[15]制备了一种纳米结构水溶胶的自组装肽。利用自身诱导方法在pET载体上成功表达SUMO融合蛋白。亲和层析纯化融合蛋白，SUMO蛋白酶用反相高效液相色谱法回收水中的肽。结果表明，融合蛋白产量高，β-结构肽效率高。由SUMO蛋白酶释放出来产生的不含额外氨基酸残基的肽，回收率为46%～99%。此外，Lifesensors公司相继开发出SUMOstar蛋白酶1和SUMOpro蛋白酶2，以此突破SUMO作为融合标签在真核生物外源蛋白表达时的障碍。Liu等[15]开发了一种可获得的SUMOstar融合标签，测试了几种鼠UBP43、人类胰蛋白酶βⅡ、USP4、USP15和GFP蛋白质在昆虫内的表达。研究结果表明，SUMOstar融合蛋白的表达水平与之前相比至少增强4倍，证明SUMOstar融合标签可以有效阻止细胞内SUMO蛋白酶的切割，并在一定程度上增加蛋白的表达。

4 结语

尽管SUMO在蛋白表达方面具有良好的优势，但将其规模化应用还具有一定的限制性。在某些方面，它的蛋白表达水平仍然低于其他的融合标签，今后有关SUMO的表达应用还需进一步摸索。

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