MicroRNA联合TCT、HC2-HPV检测高危人乳头瘤病毒对早期宫颈癌的诊断价值

李永杰，王琛

（河南大学淮河医院 妇产科，河南 开封 475000）

宫颈癌临床较常见，呈现出癌变重、发现晚及病亡率高等特征，在女性恶性肿瘤中居第2位，仅次于乳腺癌，已经严重危害女性健康。宫颈癌病变的主要危险因素是高危型人乳头状瘤病毒（high risk type human papilloma virus，HR-HPV）长期感染诱发[1]。近几年相关研究显示，99%以上的宫颈癌患者主要病因发生发展是HR-HPV感染所致。目前，薄层液基细胞学检查（thinprep cytology test，TCT）在宫颈癌的诊断、治疗等方面得到普遍应用，成为筛查宫颈癌的常规方法[2]。而第2代杂交捕获试验（hybrid captureⅡ，HC2）能够对宫颈管代谢物HR-HPV及癌前病变实施有效临床分析检测，由于宫颈癌的发生、发展过程时间较长，在癌前病变期若能够尽早发现并尽早治疗，可以有效预防其恶化，提高患者的生存率，故宫颈癌的早期筛查十分重要[3]。同时，HC2-HPV-DNA检测结果可能因某些基因蛋白特异性表达而不能达到常规仪器检测或癌变征兆，易发生漏诊。而随着近些年分子生物学与基因遗传学的发展，发现血清标志物微小RNA（MicroRNA）与宫颈癌进展存在紧密联系，且有细胞特异性，参与癌细胞的增殖、分化及凋亡等周期过程，实时调控癌基因活性发挥关键的生物学作用[4]。故Micro RNA联合TCT、HC2-HPV-DNA基因检查，成为妇女宫颈疾病方面较为前沿的诊断技术，具有较高的敏感性与特异性[5]，而目前相关方面报道较少。故本文对来我院妇产科门诊就诊的疑似宫颈癌患者进行临床分析，旨在研究Micro RNA、TCT与HC2-HPV基因检查对早期宫颈癌筛选的临床应用价值，提高早期诊断率，为临床提供一定的参考指标。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年2月-2016年2月本院就诊的疑似宫颈癌患者150例作为观察组。平均年龄（35.26±5.32）岁，所有患者均在知情且自愿的情况下并通过伦理委员会参加本研究。对宫颈肥大、溃疡或糜烂等不同程度症状表现的患者实施TCT、MicroRNA、HC2-HPV检测与宫颈病理活检。

1.2 方法

MicroRNA提取：采集研究对象宫颈样本，依照Trizol试剂盒标准严格实施每一步，所得mRNA A260/280调节1.8以上。Real-time PCR反应：依照Access RTPCR System严格操作，并依据GenBank设计对应序列引物（a为正向引物，b为反向引物）：MicroRNA-203-Fa GTGAAATGTTTAGGACCACTAGAA，Micro RNA-203-Rb GCTGTCAACGATACGCTACGT；U6 RNA-Fa CGCTTCGGCAGCACATATAC，U6 RNA-Rb TTCACGAATTTGCGTGTCAT。其中，将cDNA、引物和SYBR Green混合，Real-time PCR条件为：95℃预变性5 min，后95℃变性10 s 60℃退火，72℃延伸20 s，共40个循环。Real-time PCR使用Applied Biosystems 7000扩增仪进行。所有样品做3复孔，记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值，以U6作为内参照，采用定量PCR中的相对定量法，以2-ΔΔCt表示目的miRNA的表达相对于内参的变化倍数，其中Δ△Ct=Ct-miRNA-CtU6。

TCT：严格按照TCT取样要求制成薄层涂片，经巴氏染色后送到病理科检测。宫颈细胞学诊断根据国际癌症协会核定的贝塞斯达系统（the Bethesda system，TBS）分类标准[6]，根据细胞异型性的严重程度依次诊断为正常范围（normal range，NR）、意义不明的不典型鳞状细胞（atypical squamous cells of undermined significance，ASCUS）、低度鳞状上皮内病变（low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高度鳞状上皮内病变（high degree of squamous intraepithelial lesion，HSIL）、鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）和腺癌。将≥ASCUS诊断为阳性。

HC2-HPV-DNA检测：采用美国Digene公司提供的HPV-DNA技术进行严格制样并检测，13种高危型 HPV（16、18、3l、33、35、39、45、5l、52、56、58、59、66与68），判断标准：相对光单位（relative light unit，RLU）/Cutoff（阈值）≥1.0诊断为HPV阳性。

病理组织活检[7]：操作医师在阴道镜下对可疑位多点活检，将组织送病理科检测。根据2013版《病理学》子宫颈肿瘤组织学标准：良性细胞改变（benign cell change，BCC）、不典型增生轻度（cervical intraepithelial neoplasia-I，CIN-I）、 中 度（cervical intraepithelial neoplasia-Ⅱ，CIN-Ⅱ）、重度（cervical intraepithelial neoplasia-Ⅲ，CIN-Ⅲ）及SCC。病变在CIN-Ⅰ及以上为组织学阳性。

1.4 评定指标

根据病理学诊断结果为金标准，计算TCT、HC2-HPV及MicroRNA相对表达量的敏感性、特异性及诊断符合率。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验；计数资料用率（%）描述，并行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCT诊断结果与病理学结果比较

TCT诊断结果（NR、ASCWS、LSIL、HSIL、SCC）与病理学结果（BCC、CIN-I、CIN-II、CINIII、SCC）比较，差异有统计学意义。TCT诊断结果≥ASCUS有73例（73/150）呈阳性，占48.67%，病理学结果≥CIN-I有79例（79/150），占52.67%。见表1。

2.2 HC2-HPV诊断结果与病理学结果比较

不同病理学诊断结果（BCC、CIN-Ⅰ、CIN-Ⅱ、CIN-Ⅲ、SCC）与HC2-HPV阳性率差异较大，且其随宫颈癌变严重程度逐渐升高，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 MicroRNA相对表达量与病理学结果比较

不同病理学诊断结果（BCC、CIN-Ⅰ、CIN-Ⅱ、CIN-Ⅲ及SCC）与不同microRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），miRNA-21与miRNA-193b表达量随宫颈癌变严重程度逐渐升高，表明其有促进癌变周期发生、发展；而miRNA-124与miRNA-195表达量随宫颈癌变严重程度逐渐降低，表明其有抑制癌变周期发生、发展。血清microRNA相对表达量的检测可以直接预估宫颈癌变情况，有直接指导价值。见表3。

表1 TCT诊断结果与病理学结果比较 例（%）

表2 HC2-HPV诊断结果与病理学结果比较 例（%）

2.4 患者TCT与HC2-HPV诊断结果比较

HC2-HPV阳性率随宫颈癌变严重程度逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

2.5 MicroRNA相对表达量、TCT、HC2-HPV检测对宫颈癌患者诊断结果比较

MicroRNA联合TCT、HC2-HPV检测的敏感性为98.73%，特异性为98.59%，高于单项microRNA、TCT、HC2-HPV或者联合microRNA+TCT、HC2-HPV+TCT及microRNA+HC2-HPV的比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；同时microRNA联合TCT、HC2-HPV检测的诊断符合率为98.67%，也优于单项或者两项联合（P＜0.05）。此外，microRNA的敏感性、特异性及诊断符合率优于单一TCT、HC2-HPV的。见表5。

表3 MicroRNA相对表达量与病理学结果比较 （u/ml，±s）

表3 MicroRNA相对表达量与病理学结果比较 （u/ml，±s）

注：1）与BCC比较，P ＜0.05；2）与CIN-Ⅰ比较，P ＜0.05；3）与CIN-Ⅱ比较，P ＜0.05；4）与CIN-Ⅲ比较，P ＜0.05

项目 BCC CIN-Ⅰ CIN-Ⅱ CIN-Ⅲ SCC F值 P值miRNA-21 121.32±10.32 135.26±15.571） 226.31±29.251）2） 334.13±37.461）2）3） 411.45±43.641）2）3）4） 752.611 0.000 miRNA-124 106.52±13.21 81.36±8.371） 67.37±6.381）2） 51.25±5.721）2）3） 39.35±5.121）2）3）4） 191.492 0.000 miRNA-193b 104.13±12.35 129.42±15.571） 151.38±24.231）2） 192.46±32.371）2）3） 245.58±39.691）2）3）4） 175.880 0.000 miRNA-195 92.79±9.48 77.25±7.351） 61.21±6.421）2） 45.26±5.531）2）3） 36.36±4.791）2）3）4） 229.085 0.000

表4 患者TCT与HC2-HPV诊断结果比较 例（%）

表5 MicroRNA相对表达量、TCT、HC2-HPV对宫颈癌患者诊断结果比较 例（%）

3 讨论

宫颈癌防治重点是在早期宫颈癌前病变进行有效筛查并采取合理的治疗与预防措施。随着医疗技术的不断进步以及人们保健意识的提高，大多数生育期女性的初期官颈癌可以被及时诊断。早期普遍采用TCT技术可以提高宫颈上皮内瘤变的诊断率，具有较高的敏感性与特异性[8]。本研究结果显示，TCT诊断（NR，ASCUS、LSIL、HSIL、SCC）与病理学结果（BCC、CIN-Ⅰ、CIN-Ⅱ、CIN-Ⅲ及SCC）比较有差异。TCT诊断结果≥ASCUS呈阳性占48.67%，病理学结果≥CIN-I占52.67%，说明单一的TCT诊断存在一定的阳性预测率，但预测值较低，故容易出现漏检、假阴性情况[9]。有研究表明，高危型HPV感染往往与宫颈癌变密切相关，而HC2-HPV具有简便易行，较高的HPV阴性预测率也被逐渐采用[10]。本研究结果显示，不同病理学诊断结果与HC2-HPV阳性率差异较大，且其随宫颈癌变严重程度逐渐升高，有差异。其中HC2-HPV阴性率较高，与以上报道一致。有研究显示，HC2-HPV与TCT可提高阳性检出率，降低漏检[11]。此外，本研究进一步分析HC2-HPV与TCT诊断结果，发现HC2-HPV阳性率随宫颈癌变严重程度逐渐升高，比较有差异，进一步揭示宫颈癌早期采用HC2-HPV与TCT有一定诊断效果。此外，研究报道证实，microRNA在HPV活性周期中发挥关键调控作用，具有下调抑癌基因表达及癌细胞增殖作用，且与宫颈癌细胞分化、转移有直接联系[12]。本研究结果显示，不同病理学诊断患者中不同microRNA相对表达量有差异，miRNA-21与miRNA-193b表达量随宫颈癌变严重程度逐渐上升，表明其有促进癌变周期发生、发展[12]；而miRNA-124与miRNA-195表达量随宫颈癌变严重程度逐渐下降，表明其有抑制癌变周期发生、发展。血清microRNA相对表达量的检测可以直接预估宫颈癌变情况，有直接指导价值[13]。

另外，有研究报道证实，microRNA联合TCT、HC2-HPV基因检测可以有效提高诊断的准确率和敏感性[14-15]。本研究结果显示，新型肿瘤标志物micro RNA的敏感性、特异性及诊断符合率优于单一TCT、HC2-HPV。同时microRNA联合TCT、HC2-HPV检测的敏感性为98.73%，特异性为98.59%及诊断符合率为98.67%，高于单项microRNA、TCT、HC2-HPV两种或者联合如microRNA+TCT、HC2-HPV+TCT及microRNA+HC2-HPV，比较有差异。揭示联合应用可以更加准确诊断早期宫颈癌情况，采用联合方法诊断结果可优势互补，在临床宫颈癌前期病变诊断方面应大力推广[16-17]。

综上所述，采用microRNA联合TCT、HC2-HPV，用于宫颈癌患者的诊断及病情评估，具有较高的敏感性、特异性及诊断符合率，在临床有较高的诊断价值。

[1] 袁敏, 程静新, 刘雅歆, 等. 新疆南部维吾尔族HPV16阳性宫颈鳞癌microRNA筛选及功能分析[J]. 中南大学学报医学版,2015, 40(7): 701-709.

[2] DUCANCELLE A, REISER J, PIVERT A, et al. Home-based urinary HPV DNA testing in women who do not attend cervical cancer screening clinics[J]. Journal of Infection, 2015, 71(3): 377-384.

[3] 聂小毳, 史玉林, 丛建萍, 等. 宫颈上皮内瘤变锥切术切缘阳性的相关因素分析[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2016, 23(4): 262-265.

[4] WANG Q, QIN J, CHEN A, et al. Downregulation of microRNA-145 is associated with aggressive progression and poor prognosis in human cervical cancer[J]. Tumor Biology, 2015,36(5): 1-6.

[5] 辛婧, 徐银胜, 张芳, 等. MicroRNA-124对人宫颈癌的抑制作用及机制研究[J]. 中国生物工程杂志, 2015, 35(10): 13-19.

[6] van POELGEEST M I, VISCONTI V V, AGHAI Z, et al. Potential use of lymph node-derived HPV-specific T cells for adoptive cell therapy of cervical cancer[J]. Cancer Immunology Immunotherapy,2016, 65(12): 1451-1463.

[7] 杨光华. 病理学[M]. 第8版, 北京: 人民卫生出版社, 2013:312-313.

[8] 杨焯. 碘试验下宫颈活检联合阴道镜检查在早期宫颈癌诊断中的作用[J]. 中国内镜杂志, 2014, 20(11): 1153-1158.

[9] NING W, WEI H, YIN D, et al. MicroRNA-195 inhibits proliferation of cervical cancer cells by targeting cyclin D1a[J].Tumor Biology, 2016, 37(4): 4711-4720.

[10] 赵文霞, 茅彩英, 朱向宇, 等. HPV与TCT联合作为宫颈癌初筛的临床意义[J]. 中国妇幼保健, 2014, 29(2): 187-189.

[11] LIANG H, FU M, ZHOU J, et al. Evaluation of 3D-CPA, HRHPV, and TCT joint detection on cervical disease screening[J].Oncology Letters, 2016, 12(2): 887-892.

[12] 魏丽惠. 从不同视角看以HPV检测作为宫颈癌初筛的方法[J].中国妇产科临床杂志, 2016, 17(1): 1-2.

[13] BOTTARI F, SIDERI M, GULMINI C, et al. Comparison of onclarity human papillomavirus (HPV) assay with hybrid capture II HPV DNA assay for detection of cervical intraepithelial neoplasia grade 2 and 3 lesions[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2015, 53(7): 2109-2114.

[14] 沈丹华. 宫颈癌前期病变命名变化以及对于病理诊断与临床处理的影响[J]. 中国妇产科临床杂志, 2015, 16(1): 83-84.

[15] XUE F, YI H, RU X. MicroRNA-21 is a potential indicator for the pathological progression of cervical cancer[J]. 2016, 9(4): 4523-4530.

[16] 张涛, 毛世华, 唐良萏. 宫颈上皮内瘤变及早期宫颈癌组织中P16、HPV L-1壳蛋白的表达及与HR-HPV载量相关性研究[J].实用妇产科杂志, 2016, 32(7): 536-539.

[17] 杜文霞, 姬霞. miR-193b在宫颈癌中的表达与功能及其对化疗敏感性的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2016, 32(7): 1241-1245.